根据实验结果对毒物进行毒性评价,称为一般毒性评价(evaluationforgeneral toxity)。毒物的一般毒性作用研究是毒理学的重要内容;是化学物毒理学安全性评价和危险度评定的基础;防治毒物所致急、慢性中毒;制订卫生标准及管理毒理学决策均有重要意义。
一般毒性(general toxicity)分为:急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性
所进行的用以观察毒效应、评价化学毒物综合毒性的哺乳动物试验分为:急性毒性试验、亚慢性毒性试验和慢性毒性试验
一般毒性评价目的:1.确定受试物毒作用表现和性质;2.确定受试物毒作用剂量-反应/效应关系;3.确定毒作用靶器官;4.确定损害是否可逆。
一般毒性品评价试验动物选择:物种选择:1.吸收、代谢、生物化学和毒理学特征与人类最接近;2.易于饲养和操作;3.经济、易获得;4.自然寿命不太长。品系:品系纯化,有稳定性和可比性;选用两种以上动物级别:清洁级或以上动物;SPF(无特殊病原体动物)及GF(无菌动物)性别:一般为雌雄各半;敏感性有性别差异时应选择敏感的性别年龄、体重:1.急性毒性评价试验用成年动物2.亚慢性、慢性评价试验用年幼或初断乳动物体重不超过平均体重20%,或按规定。检疫:检疫期内出现异常者应放弃。
染毒方式:1.经口(胃肠道)染毒:喂饲、灌胃、吞咽胶囊;2.经呼吸道染毒:吸入接触(静式吸入动式吸入)、受试物注入动物气管3.经皮肤染毒:定性试验、定量试验4.经注射途径染毒:腹腔注射、静脉注射、肌内注射、皮下注射。
急性毒性(acute toxicity):指机体(人或实验动物)一次接触或24h内多次接触化学物后,短期(14d内)发生的毒性效应,包括一般行为、外观改变、大体形态变化及死亡效应。
一次接触指瞬间给实验动物染毒,如经口、经注射途径染毒。但经呼吸道或经皮,则指在特定期间使动物持续接触化学物的过程。“一次”含有时间因素。此外,当化学物毒性很低需给予较大剂量时,可在24h内多次给予,这时的急性接触即为“多次”。
急性毒性试验的目的:测出化合物一种或几种动物的LD50及其它急性毒性参数,以了解急性毒作用强度;②探索急性毒性的剂量-反应关系,并通过观察中毒表现和死亡的情况,了解急性毒作用性质、可能的靶器官,初步评价对人损害的危险性。③为进一步毒理学试验剂量设计提供参考。④提供毒理学机制研究的初步线索。
急性毒性试验常用参数最常用的是LD50(或LC50)其次为Zac(LD50/Limac) 在一些毒性上、下限指标中,目前主张用LD84/LD16或LC84/LC16的比值。比较2种以上,LD50相同/近似的毒物的致死毒性时还可用毒物的剂量-反应曲线斜率(死亡率概率单位与剂量对数回归直线的斜率)表示。
急性毒性试验物种选择:以选择哺乳动物为主,首选大鼠:年龄与性别:成年大鼠,一般雌雄各半;雌、雄分别求LD50。若是为致畸试验作准备,可仅作雌性LD50。染毒剂量与分组:
了解化学物的一般性质预实验剂量设计:有相关资料(找出近似化合物资料、设定预期毒性中值、以4倍计量差为组距设计剂量组);无相关资料(最大耐受剂量试验、最低剂量组试验)正式试验剂量设计:寇氏法、改进寇氏法(又称Karber法或平均致死量法);Horn法;Bliss法(又称最大似然性法)。经典方法替代方法:限量试验、固定剂量法、急性毒性分级法、上-下移动法
【改进寇氏法:利用剂量对数与死亡率呈S型曲线设计,又称Karber法或平均致死量法。优点:计算简便、准确率高。要求:每组动物数相同,组距等比,死亡率呈正态分布,最
低剂量组死亡率<20%,最高剂量组死亡率>80%。
Bliss法:又称最大似然性法,是最精确的LD50计算方法。我国《新药临床前毒理学研究指导原则》及《新药(西药)毒理技术要求规范》均推荐此法。设计要求不像前三法那么苛刻。
但计算较复杂,多利用计算机软件(如中山医科大编制的《多功能半数致死量软件》)运算。
Horn氏法:利用剂量对数与死亡率的概率单位呈直线关系而设计,又称平均移动法或剂量递增法。优点:省动物;可直接查表求出LD50及其95%可信限。缺点:LD50的95%可信限范围大,方法精确度不够。分4个剂量组;每组动物数相等,4或5只;剂量组距为等比;按剂量范围宽窄,分2个剂量系列(组距2.15倍或组距3.16倍)。根依据每组动物数、组距和每组死亡数,查表求出LD50及其95%可信限。
序贯法:利用序贯设计原理,又称平均数法、阶梯法或上-下法,先用一剂量试验,若动物死亡,则用下一个较小剂量试验,若仍死亡则以更小剂量试探;如动物存活,则以较大剂量
试探,依次类推,最终求出LD50。优点:节省动物,一般12~14±只即够。缺点:只适于快速出现中毒反应及死亡的毒物,不适合迟发性毒物。】
动物数与分组:根据评价程序规定采用的LD50计算方法。概率单位法、改进寇氏法、Bliss法要求5~7个剂量组,每组10只动物或10只以上;霍恩氏(Horn)法要求4个剂量组组动物,每组4或5只;序贯法(平均数法、阶梯法、上-下法):由第一只动物反应决定第二只接受剂量,一般使用12~14只;固定计量法:4个剂量,每个剂量至少10只;急性毒性分级法:平均2~4个阶段,每阶段3只。
急性毒性替代试验:固定剂量法:预先选定或固定的一系列剂量染毒,观察化学物的毒性反应,进行分级。不以动物死亡为观察终点。急性毒性分级法:应用于啮齿类动物,以死亡为终点从三个固定剂量中选一个,分阶段进行。每阶段3只,根据死亡动物数进入下一阶段,以较高或较低水平进行试验。上下移动法:以死亡为终点,需要选择一个较合适的剂量范围。根据资料初步确定第一个动物接受的剂量,由该动物染毒后反应,决定第2只动物接受的剂量。
试验周期与毒效应观察: LD50(LC50),要求计算染毒后14d内的死亡数。对速杀型毒物,可按24h死亡率求LD50(LC50),与14dLD50(LC50)往往无明显差别,但报告中应注明
为24hLD50(LC50),便于毒性比较。观察中毒表现,对了解急性毒作用特征很重要,可补充单纯以LD50(LC50)表示急性毒性的不足。
中毒表现:中毒症状:出现的中毒症状、时间、发展经过、死前特征及死亡时间等。
主要观察内容见表6-2。体重:在观察期14d内称存活动物体重变化,以了解毒效应持续时间。病理检查及其它指标:死亡动物及时作大体解剖和病理组织学检查,观察期结束时对存活动物进行大体病理检查,必要时做组织病理学检查。死亡及死亡时间:观察和记录每只动物的死亡时间,特别是最早死亡时间及各组死亡数。
LD50 意义:标化化学物毒作用强度,评价毒性大小;计算毒性剂量距离;为后续的试验提供参考剂量;比较不同途径的LD50值,提供生物利用度信息; LD50试验结果外推至人的致死剂量和中毒症状。
LD50试验局限性:可提供的有效信息少;波动性大;物种差异、个体差异明显;经典试验
耗费动物较多。
局部刺激试验(local toxic effect):亦称局部刺激试验,指机体暴露与化学物后,在其接触和暴露部分造成的局部毒性损伤、刺激(如眼刺激、皮肤刺激)和或变态反应等。
局部刺激试验目的:了解外源化学物对皮肤、眼睛的局部刺激性和腐蚀性,包括眼刺激、皮肤刺激试验。在我国,农药、化学品和消毒剂试验程序规定局部刺激试验为必做项目
眼刺激试验观察终点:眼刺激:眼前表面接触受试物后眼睛产生可逆性炎症变化;眼腐蚀:眼前表面接触受试物后眼睛产生不可逆性组织损伤。观察内容:结膜:红、球结膜水肿、分泌物角膜:混浊范围及程度虹膜:充血、肿胀、角膜周围充血。观察期限:一般为7天,必要时可延长至21天
皮肤原发性刺激试验观察终点:皮肤刺激和皮肤腐蚀;观察内容:色斑、水肿。观察时间:症状消失或出现不可逆刺激,不超过14天。不适宜做皮肤刺激试验情况强腐蚀性物质(pH<=2,pH>11.5);急性经皮试验显示强系统毒性;急性经皮试验染毒剂量至2000mg/kg时无皮肤刺激。影响因素:1.皮肤完整性;2.固态受试物物理特性;3.受试物溶解状态;4.受试物染毒时封闭严密程度;5.实验动物年龄及受试部位;6.动物种属差异;7.个人主管判断差别;8.人实际接触受试物方式与试验动物接触方式差异。
皮肤反应敏感性顺序:兔>豚鼠>人>猪;试验结果外推至人时应注意
眼刺激替代试验:鸡胚绒毛膜尿囊膜试验、绒毛膜尿囊膜苔盼蓝染色试验、荧光素漏出试验
皮肤刺激替代试验:人工皮肤模型
皮肤致敏:对化学物的免疫介导反应在皮肤上表现出一系列症状。人体可见瘙痒、红斑、水肿、丘疹、小水疱、大疱等。动物反应常仅见红斑和水肿。
皮肤致敏试验分为福氏完全佐剂法、不加佐剂法(不加佐剂,抗原量增大到10~20倍)
皮肤致敏试验目的:预测化学物经皮接触对人引起皮肤致敏的危害
皮肤致敏试验方法:检疫——脱毛、观察有无破损—(24小时后)—诱导接触—(10~14天)—激发接触—(24h后)—观察结果(24h、48h、72h)——分析评价。观察内容:色斑、水肿
皮肤刺激试验与皮肤致敏试验的区别:皮肤刺激试验:一次接触一定时间后观察可逆或不可逆作用,一般观察不超过14天;皮肤致敏试验:a诱导接触:低浓度或中等浓度受试物对皮肤重复染毒;b间隔10~14天;c激发接触:低于诱导剂量对动物未染过毒的皮肤涂抹,观察24h、48h、72h皮肤反应
短期、亚慢性和慢性毒作用
蓄积作用(accumulation)
储存库(depot)。
物质蓄积(material accumulation)
功能蓄积(functional accumulation)
蓄积作用意义:蓄积作用是慢性中毒的基础。求出蓄积系数K,了解化学物蓄积毒性的强弱,为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供基础资料。应用:若大鼠经口LD50>5000mg/kg,或已作过代谢试验有T1/2数据者,可不做蓄积毒性试验。注意急性非致死性实验主要靶器官是否与亚急性试验一致。
蓄积系数法:以生物效应为指标,用经验系数(K)评价蓄积作用,即将多次染毒与一次染毒所产生的毒性效应(或死亡)进行比较。
蓄积系数(accumulation coefficient):是多次染毒使半数动物出现效应(或死亡)的累积剂量
[ED50(n)]与一次染毒使半数动物出现相同效应(或死亡)的剂量[ED50(1)]的比值,即K=ED50(n)/ED50(1),试验中多用小鼠或大鼠,以死亡一半为效应指标,K值计算公式也可改为K=LD50(n)/LD50(1)
蓄积系数分级标准:
蓄积系数(K) 蓄积毒性分级
<1 高度蓄积
1~明显蓄积