ʌ方药研究ɔ
基于中药整合药理学平台的参桃软肝方抗癌
分子机制研究
❋
刘展华1，庄振杰2，林丽珠1ә，黄慈辉2，孙治中2，李佳容2
(1.广州中医药大学第一附属医院，广州㊀510405;2.广州中医药大学，广州㊀510405)
㊀㊀摘要：目的：基于中药整合药理学平台筛选参桃软肝方抗癌治疗的主要成分及作用靶点，构建相关网络对参桃软肝方的抗癌机制进行预测分析㊂方法：借助中药整合药理学平台及DAVID 数据库对参桃软肝方行整合药理学分析，从多角度探索其抗癌机制㊂结果：研究结果表明，参桃软肝方中具有抗癌作用的药物成分种类丰富，抗癌治疗的关键靶点主要包括ADORA3㊁RHOA ㊁AKT1㊁KRAS ㊂涉及的关键通路包括T 细胞受体信号通路㊁癌症通路及趋化因子信号通路，涉及的参桃软肝方潜在治疗癌种包括结直肠癌㊁胰腺癌㊁慢性髓性白血病等㊂结论：参桃软肝方具有多成分㊁多靶点干预肿瘤疾病的特点㊂本研究结果初步阐明参桃软肝方抗癌治疗的药效成分㊁作用靶点㊁分子通路及潜在的治疗癌种，为进一步深入揭示其作用机制奠定了基础㊂㊀㊀关键词：参桃软肝方；抗癌机制；肿瘤；整合
药理学平台
㊀㊀中图分类号:R289.5㊀㊀文献标识码:A㊀㊀文章编号:1006-3250(2021)01-0124-07
Molecular Anti-Cancer Mechanism Rearch on Shentao Ruangan Recipe Bad on
Integrative Pharmacology
LIU Zhan-hua 1,ZHUANG Zhen-jie 2,LIN Li-zhu 1ә,HUANG Ci-hui 2,SUN Zhi-zhong 2,LI Jia-rong 2(1.The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chine Medicine,Guangzhou University of
Chine Medicine Guangzhou 510405,China;2.Guangzhou University of Chine Medicine,Guangzhou 510405,China)㊀㊀Abstract :Objective :To further investigate the potential molecular mechanism and active components of Shentao Ruangan recipe for treating cancer.Putative targets of Shentao Ruangan recipe were predicted and herbs-ingredients interaction network ,ingredient-targets interaction network were constructed bad on integrative pharmacology.Method :The traditional Chine medicine of Integrative pharmacology databa and DAVID databa were applied to preform integrative pharmacology analysis of Shentao Ruangan re
cipe.The underlying mechanisms of Shentao Ruangan recipe for cancer treatment were analyd from multi-angles.Result :This study found that multiple ingredients of Shentao Ruangan recipe could exert therapeutic effect on cancer.The anti-cancer effect of Shentao Ruangan recipe was mainly associated with the hub targets including :ADORA3,RHOA ,AKT1,and KRAS.The hub pathways involved were T cell receptor signaling pathway ,pathways in cancer ,and chemokine signaling pathway.In addition ,Shentao Ruangan recipe might exert therapeutic effects on colorectal cancer ,pancreatic cancer ,chronic myeloid leukemia and other cancers.Conclusion :Shentao Ruangan recipe could treat cancer through multiple ingredients and multiple targets.The prent study preliminarily revealed the active ingredients ,hub targets ,molecular pathways and potentially curable cancer types of Shentao Ruangan recipe ,which will contribute to the further rearches of this effective formula.
㊀㊀Key words :Shentao Ruangan recipe ;Anti-cancer mechanism ;Cancer ;Traditional Chine medicine of Integrative pharmacology (TCMIP )
❋基金项目：广东省中医药管理局科研项目(20183003)-参桃软肝片对HBx 蛋白导致的肝癌DNA 甲基化状态的影响；广州中医药大学第一附属医院创新强院工程项目(2016ZJ04)-参桃软肝片制剂研究
作者简介：刘展华(1965-)，女，广东潮州人，主任医师，博士研究生，博士研究生导师，从事肿瘤的中西医结合临床与研究㊂
ә通讯作者：林丽珠(1962-)，女，广东汕头人，主任医师，博士研究生，从事肿瘤的中西医结合临床与研究,Tel :86+20-39358466,E-mail :lizhulin903@139 ㊂
㊀㊀癌症已经成为严重影响人类生命健康的常见疾病，近年来其发病率和死亡率不断呈现出上升趋势㊂美国癌症学会发布的癌症全球流行病学报告[1]显示,2018年全球癌症发病例数1810万，其中有960万人因癌症疾病而死亡㊂在中国，癌症的发病形势同样严峻㊂国家癌症中心发布的‘全国癌症统计报
告2018版“[2]显示,2014年全国恶性肿瘤估计新发病例数380.4万例(男性211.4万例，女性169.0万例)，平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7个人被确诊为癌症，癌症日益严峻的发病形势给抗癌的治疗和预防带来了巨大的社会医疗压力㊂中医学源远流长，在长期的防治肿瘤疾病的实践中形成了基于中医理论指导的具有鲜明特色的中医肿瘤学科体系㊂中医在预防肿瘤发生以及抗癌治疗减毒增效㊁抗耐药㊁抑制复发转移等方面具有明显优势，已成为防治肿瘤疾病不可或缺的重要医疗措施[3]㊂
参桃软肝方是国医大师周岱翰教授治疗肝癌常用经验方，主方由山慈菇㊁桃仁㊁半枝莲㊁当归㊁人参㊁白术㊁甘草㊁仙鹤草8味药组成㊂本方以 健脾祛瘀
法 组方，针对于癌邪 虚 与 瘀 的病理特点，功能健脾养肝㊁软坚消癥，其在培补脾气㊁滋养肝阴的同时，兼顾活血化瘀㊁软坚消癥，常用于肝癌的不同临床阶段，具有改善肝功能㊁缓解黄疸㊁腹水等临床症状等疗效㊂研究证实，本方联合肝癌的常规治疗，可提高中晚期原发性肝癌患者的疾病控制率，延长患者生存时间，同时保护患者肝功能，提高患者生存质量[4]㊂鉴于其良好的临床疗效，目前以本方为基础研制而成的参桃软肝胶囊[5-8]㊁参桃软肝丸[9-15]㊁参
桃软肝片[16-17]等口服制剂已逐渐运用于临床及相关研究㊂但参桃软肝方抗癌分子机制尚未完全阐明，同时其治疗肝癌外适应证仍有待进一步探索㊂中药方剂治疗疾病的过程中涉及多成分㊁多靶点的协同作用，单一的 药物-靶点-基因 的研究模式难以对中药方剂作用过程及机制形成系统正确的认识㊂针对目前存在研究模式的不足，相关学者借助中医药大数据联合计算机平台提出 整合药理学 的研究新模式㊂该模式立足于药物靶点预测㊁网络构建及功能分析等不同分析模块，是探索中药方剂化学物质实体与机体生命活动交互规律的一种新模式[18-19]㊂中药整合药理学计算平台( www.Tcmip/)是这一模式下的研究实践平台，该平台是以中医药大数据为基础，以人工智能㊁数据建模和数据挖掘㊁网络科学等学科方法和技术为支撑，构建的用于中药整合药理学分析的计算机平台[19]㊂该平台可运用于中药药效物质基础分析㊁中药有效成分分子机制探讨㊁中药质量控制㊁中药新药研发以及中药临床精准用药等方面，同时也可为揭示中医原创思维的科学价值和传承名医经验提供一定的技术支撑[20-21]㊂
本研究旨在基于中药整合药理学计算平台及相关数据库，运用整合药理学方法对参桃软肝方中潜在的抗癌主要成分㊁作用靶点以及信号通路进行分析，为进一步借助实验探究其确切的抗癌机制以及临床新药研发提供依据㊂
1㊀数据来源与方法
1.1㊀参桃软肝方的活性成分来源
在整合药理学平台(http:ʊip/)的中药成分数据库中，收集 山慈菇 桃仁 半枝莲 当归 人参 白术 甘草 仙鹤草 8味中药的活性成分，建立参桃软肝方的化学成分数据库㊂1.2㊀药物及疾病靶点预测与获取
整合药理学平台通过Open Babel提取参桃软肝方药物成分的化学分子指纹，并将其与Drug Bank 中获FDA批准的抗癌药物指纹进行比对，平台利用Tanimoto系数对结果进行评分，选定评分>0.8的为相似性药物，将相似性药物靶点作为参桃软肝方的潜在作用靶点[22]㊂以 cancer 及 tumour 为疾病关键字在整合药理学平台的疾病靶点数据库中进行检索，检索结果为治疗 cancer 及 tumour 的疾病靶点，建立癌症靶点数据库，将数据库中的靶点结果作为参桃软肝方的候选靶点来源㊂
1.3㊀蛋白质-蛋白质相互作用网络构建与分析
整合药理学平台整合了In Act㊁DIP㊁MINT㊁HA 蛋白互相作用㊁OPHID㊁PDZBa㊁Reactome㊁HPRD 等8个现有蛋白相互作用网络数据库的信息，通过整合药物学平台的蛋白相互作用网络，构建参桃软肝方药物的潜在作用靶点-癌症疾病靶点的蛋白相互作用网络[22]㊂通过整合药理学平台的网络分析模块蛋白互相作用网络进行拓扑分析，以 节点连接度 的2倍中位数为卡值，选取中药靶点-疾病基因的关键节点(hubs)；在此基础上，以 节点连接度 (degree) 节点紧密度 (cloness) 节点介度 (betweenness)的中位数为cutoff值，选取同时满足3个卡值的节点为参桃软肝方潜在靶点-癌症疾病靶点互作网络的关键靶点㊂
1.4㊀基因功能和通路分析
中药整合药理学平台整合了GO(Gene Ontology)(tology)和KEEG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)(http:/ /jp/kegg)两大基因组信息数据库，可对筛选出的作用靶点直接进行功能分析和通路富集分析㊂使用整合药理学平台中这2个模块分别对参桃软肝方潜在作用靶点㊁参桃软肝方抗癌治疗的关键靶点进行GO及KEGG分析[22]，按P值大小分别获取具有明确条目ID的前20个GO及KEGG分析结果㊂
1.5㊀共同关键靶点通路分析
将获取的参桃软肝方与癌症疾病共同靶点，使用DAVID数据库(Version6.8https:ʊdavid. v/)[23]
进行KEGG通路分析，将获得结果中P值有统计学意义的前20个通路与参桃软肝方抗癌治疗的关键靶点KEGG通路分析结果进行匹配，并使用R软件(version3.5.1)绘制维恩图㊂2㊀结果
2.1㊀参桃软肝方化学成分靶标预测及分析
通过对参桃软肝方成分靶点预测及分析，共收集参桃软肝方化学成分437个，其中白术成分32个，其主要成分为多糖㊁白术三醇等；半枝莲8个，其主要成分为内脂类㊁黄芩苷等；当归65个，其主要成分为多糖㊁阿魏酸等；甘草133个，人参158个，其主要成分为人参皂苷㊁人参多糖等；桃仁3个，其主要成分为苦杏仁甙㊁糖类等；仙鹤草22个，主要成分为三萜及其苷类㊁黄酮类化合物；山慈菇16个，其主要成分为糖苷类化合物及萜类化合物等㊂收集药物靶点共计3236个，其中山慈菇108个，桃仁35个，半枝莲62个，当归370个，人参2013个，白术210个，甘草360个，仙鹤草78个㊂
表1㊁2示，对参桃软肝方潜在靶点进行GO分析，结果显示潜在靶点基因涉及的生物学功能包括细胞溶质㊁外泌体㊁ATP结合㊁线粒体基质㊁线粒体电子转运等条目，根据P值大小排序，筛选具有明确ID的条目共计20条㊂KEGG通路富集结果显示，参桃软肝方潜在靶点作用的通路条目包括氧化磷酸化㊁碳代谢㊁糖酵解和糖质生成等，其涉及病种包括阿尔兹海默病㊁帕金森病㊁非酒精性脂肪性肝病等㊂根据P值大小排序，筛选具有明确ID的条目共计13条㊂
表1㊀参桃软肝方潜在靶点具有的功能信息
条目ID条目名称富集基因数目P值GO:0005829cytosol391 4.31E-102 GO:0005515protein binding603 4.00E-79 GO:0005524ATP binding212 3.25E-63 GO:0006468protein phosphorylation1058.42E-50 GO:0004672protein kina activity69 1.77E-45 GO:0019899enzyme binding81 2.80E-42 GO:0043066negative regulation of apoptotic process95 4.23E-42 GO:0019901protein kina binding889.96E-42 GO:0007165signal transduction148 1.02E-41 GO:0042493respon to drug80 3.09E-40 GO:0005654nucleoplasm247 1.68E-37 GO:0004674protein rine/threonine kina activity76 3.98E-35 GO:0005737cytoplasm353 6.92E-34 GO:0008284positive regulation of cell proliferation867.04E-34 GO:0004713protein tyrosine kina activity46 1.07E-32 GO:0046777protein autophosphorylation53 1.37E-32 GO:0005739mitochondrion146 1.39E-32 GO:0042802identical protein binding98 1.54E-32 GO:0018105peptidyl-rine phosphorylation45 6.87E-32 GO:0018108peptidyl-tyrosine phosphorylation50 1.83E-31
表2㊀参桃软肝方潜在靶点参与的通路信息
条目ID条目名称富集基因数目P值hsa05010Alzheimer's dia66 3.25E-31 hsa05012Parkinson's dia60 2.68E-30 hsa04932Non-alcoholic fatty liver dia(NAFLD)61 1.11E-29 hsa00190Oxidative phosphorylation56 2.08E-28 hsa05016Huntington's dia62 3.54E-25 hsa01
200Carbon metabolism47 3.71E-25 hsa00010Glycolysis/Gluconeogenesis34 4.01E-21 hsa00640Propanoate metabolism247.59E-21 hsa00620Pyruvate metabolism27 1.72E-20 hsa00280Valine,leucine and isoleucine degradation27 1.03E-19 hsa00020Citrate cycle(TCA cycle)227.65E-19 hsa00330Arginine and proline metabolism27 2.41E-15 hsa04724Glutamatergic synap38 3.15E-15
图1㊀参桃软肝方抗肿瘤的关键靶点网络注:RS代表人参,GC代表甘草,TR代表桃仁, BZL代表半枝莲,XHC代表仙鹤草
图2㊀参桃软肝方药物-成分-关键靶点网络
㊀㊀2.2㊀参桃软肝方抗肿瘤的关键靶点网络构建
图1㊁2表3示，经过整合药理学平台的筛选，得到参桃软肝方及 cancer & tumor 关键靶点共计780个，其中药物直接作用靶点152个，已知疾病靶点268个，药物与疾病共同靶点29个，其他靶点331个㊂将以上靶点汇总并构建 参桃软肝方潜在作用靶点肿瘤疾病靶点 的蛋白互作网络㊂蛋白互作网络中，根据节点连接度仅显示前100个靶点，连接度越大说明节点越大㊂通过该网络共确定参桃软肝方与癌症共同靶点5个，分别为ADORA3(Adenosine receptor A3)㊁RHOA (Transforming protein
RhoA )㊁AKT1(RAC-alpha rine )㊁KRAS (KRAS proto-oncogene )㊁GMPS (Guanine monophosphate syntha )㊂将参桃软肝方中靶点为包含上述5个靶点药物及其成分进行确认并进行数据整理，使用Cytoscape 软件(version 3.7)构建药物-成分-关键靶点网络图，其中参桃软肝方中有上述关键靶点且存在作用关系的成分数量为322个，通过该网络体现了参桃软肝方多成分-多靶点的药物作用关系，表明参桃软肝方可通过多成分㊁多靶点治疗癌症疾病㊂参桃软肝方中与上述5个靶点均存在相互作用关系的药物成分及数量㊁主要药物成分分类㊂
表3㊀参桃软肝方中与关键靶点有相互作用的成分及药物分类比较
药物名称药物成分总数
与SADORA3/RHOA /AKT1/KRAS /GMPS 存在均存在相互作用关系的药物成分数量
相关作用关系的主要药物成分人参2013155人参皂苷㊁人参醇白术3211白术内酯㊁苍术酮桃仁33儿茶素㊁苦杏仁苷㊁虫草素仙鹤草2222仙鹤草酚㊁仙鹤草内酯山慈菇162秋水仙碱㊁反式甲酰胺半枝莲84苦丁素㊁黄芩苷甘草133125甘草素㊁甘草皂苷当归
65
注：条形图中按-log10(P.value )值大小颜色从红色向紫色渐变,-log10(P.value )值越大则P 值越小，条目相关性越强
图3㊀参桃软肝方抗肿瘤关键靶点具有功能信息
㊀㊀BZ 代表白术,SCG 代表山慈菇，蓝色节点代表药物，绿色节点代表成分，红色节点代表关键靶点㊂
2.3㊀参桃软肝方化学成分靶标预测及分析图3㊁4示，参桃软肝方抗癌关键靶点的GO 功能分析显示，参桃软肝方药物靶点与疾病关键靶点基因功能涉及蛋白结合㊁细胞质㊁核原生质㊁ATP 结合㊁信号传导㊁蛋白质磷酸化多个条目，根据P 值大小进行排序，筛选具有明确ID 的条目共计20条㊂通过整合药理学平台进行参桃软肝方靶点通
路富集分析显示，参桃软肝方抗癌关键靶点主要涉及的通路有T 细胞信号通路㊁ERBB 信号通路㊁FoxO 信号通路㊁趋化因子信号通路㊁细胞凋亡等，涉及病种为乙型肝炎㊁慢性髓性白血病㊁结直肠癌㊁前列腺癌㊁胰腺癌等㊂根据P 值大小，筛选出具有明确ID 的条目共计14条㊂结果提示，参桃软肝方的抗癌关键靶点在上述信号通路及病种中具有重要作用㊂
2.4㊀共同靶点分析
表4图5示，将参桃软肝方关键抗癌靶点ADORA3㊁RHOA㊁AKT1㊁KRAS及GMPS使用DAVID数据库(Version6.8https:ʊifcrf. gov/)进行基因注释㊂其中ADORA3㊁RHOA㊁AKT1㊁KRAS4个基因呈现具有统计学意义的注释结果，将其所涉及的通路按P值大小选取前20个条目，将所得条目与参桃软肝方抗癌关键靶点所涉及的通路进行匹配，并使用R软件绘制维恩图，最终得到3条共同通路及2个涉及的共同病种㊂3条通路分别为T细胞受体信号通路(T cell receptor signaling pathway)㊁癌症通路(Pathways in cancer)和趋化因子信号通路(Chemokine signaling pathway),2个共同癌种为胰腺癌(Pancreatic cancer)和结直肠癌(Colorectal cancer)㊂结果表明，上述涉及的基因㊁通路及病种在参桃软肝方抗癌治疗中具有重要的作用，值得在今后的研究中进行深入探索
㊂
注：气泡图中气泡按P值大小㊁颜色从绿色向红色渐变，点的大小与富集的基因数量成正比
图4㊀参桃软肝方抗肿瘤关键靶点所参与的通路信息
表4㊀参桃软肝方抗癌治疗关键靶点的KEGG分析
ID条目名称Gene Proportion Bar Gene Count P-value hsa04071Sphingolipid signaling pathway4 4.9E-4 hsa05210Colorectal
cancer3 1.1E-2 hsa04660T cell receptor signaling
pathway3 1.9E-2 hsa04722Neurotrophin signaling
pathway3 2.1E-2 hsa04022cGMP-PKG signaling
pathway3 2.9E-2 hsa04062Chemokine signaling
pathway3 3.3E-2 hsa05205Proteoglycans in
cancer3 3.3E-2 hsa04015Rap1signaling
pathway3 3.2E-2 hsa04014Ras signaling
pathway3 3.2E-2 hsa01521Pathways in
cancer38.5E-2 hsa05213Endometrial
cancer2 1.8E-1 hsa05223Non-small cell lung
cancer2 1.7E-1 hsa05221Acute myeloid
leukemia2 1.7E-1 hsa04370VEGF signaling
pathway2 1.8E-1 hsa05230Central carbon metabolism in
cancer2 1.7E-1 hsa05212Pancreatic
cancer2 1.6E-1 hsa05214
Glioma2 1.6E-1 hsa05211Renal cell
carcinoma2 1.6E-1 hsa04664Fc epsilon RI signaling
pathway2 1.5E-1 hsa04662B cell receptor signaling
pathway2 1.5E-1㊀㊀3㊀讨论
本研究基于整合药理学方法对参桃软肝方抗癌
治疗的有效成分㊁关键靶点㊁涉及通路及潜在治疗癌
种进行分析，研究结果表明参桃软肝方在治疗癌症
方面具有多成分㊁多靶点的协同作用特点㊂参桃软
肝方是肿瘤名医周岱翰教授的经验方，方中人参为
君药大补元气，补脾益肺；白术能健脾益气；桃仁善
泄血滞㊁祛瘀力强，可治疗血闭癥瘤等多种瘀血阻滞
图5㊀共同靶点涉及通路与关键靶点涉及通路维恩图
的病证；当归可活血通经，当归㊁人参合用可补气生
