海南淮山茎腐病菌对戊唑醇的敏感性测定

海南淮山茎腐病菌对戊唑醇的敏感性测定

赵志祥;陈圆;陈绵才;肖敏;肖彤斌

【摘 要】In order to provide practical and theoretical basis for the

prevention and control of Dioscorea op posita stem rot dia ,the

bioassay method of baline nsitivity was developed on the basis of the

effect of tebuconazole on the mycelium grow th and spore germination of

Fusarium oxysporum f .sp .dioscorea .Thirty-two strains were obtained by

single spore isolation .Virulence of tebuconazole on all of the strains was

tested by the methods of mycelium grow th and spore germination .Then

virulence regression equation was constructed and the nsitive

distribution was analyd .The results showed that mycelium growth of the

pathogen was affected by tebuconazole ,with the maximal EC50 of 0.407

005 μg/mL ,minimum EC50 of 0.063 797 μg/mL , and mean EC50 of (0.228

3 ± 0.008 5)μg/mL ,respectively .And spore germination was inhibited by

tebuconazole to a greater extent ,with the mean EC50 as (0.031 8 ± 0.024

2)μg/mL ,ranging from 0.002 550 μg/mL to 0.104 858 μg/mL .Normal

distribution analysis showed that the nsitivity of mycelium growth to

tebuconazole fitted well with a normal distribution function ,but that of

spore germination did not ,for which the span between the maximal EC50

and the minimum EC50 was big .In high concentration area ,there were still

innsitive strains .This may be related to the change of environment ,and

thus a few strains possd a certain resistance .%研究海南淮山茎腐病菌株

对戊唑醇的敏感性，以期为该病害的综合防治提供实践和理论依据。通过单孢分离

获得32株茎腐病菌，分别采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定戊唑醇对各菌株

的毒力，并进行毒力回归和敏感性分析。结果表明：戊唑醇对菌丝生长具有较强的

抑制作用，其抑制中质量浓度（EC50）最小值、最大值、平均值分别为0.063797、

0.407005、（0.2283±0.0805）μg/m L ；该药对孢子萌发的抑制效果更明显，

其 EC50最小值、最大值、平均值分别为0.002550、0.104858、

（0.0318±0.0242）μg/m L。正态分析表明：菌丝生长对戊唑醇的敏感性呈正态

分布；而孢子萌发的敏感性呈非正态分布，其最大EC50和最小EC50之间的跨度

较大，EC50表现不连续，在高质量浓度区仍有不敏感菌株存在，这表明在自然界

中存在个别抗药性较强的淮山茎腐病菌株。

【期刊名称】《河南农业科学》

【年(卷),期】2014(000)006

【总页数】5页(P89-93)

【关键词】戊唑醇;淮山茎腐病;尖孢镰刀菌;菌丝生长;孢子萌发;敏感性

【作 者】赵志祥;陈圆;陈绵才;肖敏;肖彤斌

【作者单位】海南省农业科学院农业环境与植物保护研究所/海南省植物病虫害防

控重点实验室，海南海口571100;海南省农业科学院农业环境与植物保护研究所/

海南省植物病虫害防控重点实验室，海南海口571100;海南省农业科学院农业环

境与植物保护研究所/海南省植物病虫害防控重点实验室，海南海口571100;海南

省农业科学院农业环境与植物保护研究所/海南省植物病虫害防控重点实验室，海

南海口571100;海南省农业科学院农业环境与植物保护研究所/海南省植物病虫害

防控重点实验室，海南海口571100

【正文语种】中 文

【中图分类】S48

2011－2012年对海南省海口、临高和澄迈等地淮山病害进行调查发现，根状茎上

茎腐病发生严重，一般发病率在30%左右，严重地块高达80%以上。经鉴定，其

病原为尖孢镰刀菌薯蓣专化型（Fusarium rea）［1］。

由于海南淮山大量种植的时间较晚，2007年以后才陆续从广东、广西等地引进云

选1号、2号和3号品种开始大面积种植［2］，因此，对该作物上病害的研究较

晚，尤其是茎腐病作为一种新的病害在海南鲜有研究。迄今尚无抗茎腐病的材料，

生产上以化学药剂——苯并咪唑类的多菌灵和甲氧基丙烯酸酯类的嘧菌酯防治为

主。然而长期单一使用这些化学药剂，病菌易产生抗药性［3］。

戊唑醇是一种羟乙基三唑衍生物，属高效、广谱、低毒的内吸性三唑类杀菌剂。与

传统三唑类杀菌剂相比，戊唑醇不但能够抑制真菌中麦角甾醇的生物合成，还具有

其自身的优势和特性，即用戊唑醇处理后，菌丝中出现3种△5甾醇：△5－麦角甾

醇、△5－豆固醇和△5，22－豆固二烯醇，影响甾醇混合物的组成，从而扩大戊唑

醇的抗菌谱［4］。

目前，戊唑醇主要用于防治小麦［5］、水稻［6］、花生［7］、香蕉［8］和苹

果［9］等作物上的真菌病害，在全球50多个国家的60多种作物上取得登记并广

泛应用。本实验室通过室内毒力测定发现，戊唑醇对淮山茎腐病菌有较好的防治效

果。然而，该病菌对戊唑醇的敏感性尚不清楚。为此，本研究通过检测海口、澄迈、

临高等地淮山茎腐病菌对戊唑醇的敏感性，绘制敏感性分布频率图，分析抗药性产

生的可能性，以期为利用戊唑醇防治该病害提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试农药

70%的戊唑醇WP由北京华戎生物激素厂生产，试验前，先将其用无菌水配成有

效成分为10 mg／mL的母液备用。

1.2 供试培养基

培养茎腐病菌以及菌丝生长速率法测定淮山茎腐病菌对戊唑醇的敏感性试验所用培

养基为PDA培养基，配方为：马铃薯200.0g，蔗糖20.0g，琼脂粉15.0～20.0g，

蒸馏水1L，调节pH 值为7.2，121～126℃灭菌20min。抑制孢子萌发试验所用

培养基为水琼脂培养基（WA），其配方为：琼脂粉15.0～20.0g，蒸馏水1L，调

节pH值为7.0，121～126℃灭菌20min。

1.3 供试菌株的分离

从海口云龙、临高东英和澄迈大拉等淮山生产基地采集淮山病茎89份，用常规组

织分离法［10］分离茎腐病菌。然后按照刘永翔等［11］的毛细管印迹法（略作

修改）进行单孢分离。将病原菌接种于PDA平板上，28℃下培养6～8d，待菌丝

布满整个培养皿之后取出，在无菌操作台上用无菌水洗去气生菌丝，继续暗光培养

7d，无菌水洗下孢子，收集于1.5mL灭菌离心管中。同时，用打孔器在PDA平

板上打若干个培养基圆饼，并将其置于灭菌的空皿中，编号备用。取10μL孢子悬

浮液置于无菌空培养皿中，毛细管的一端插入孢子悬浮液后，在PDA平板上轻印

一下，在100倍视野显微镜下，观察并统计印迹中的孢子数目。依据孢子数目将

孢子悬浮液稀释相应的倍数后，重复上述操作，以确保每个印迹周围大约只有1

个孢子。用毛细管蘸取稀释后的孢子悬浮液，在小圆饼上轻印，并检查印迹周围孢

子数，将只有1个孢子的小圆饼放回无菌的PDA平板上，编号，28℃下暗光培养

6d，即得到茎腐病单菌株。

1.4 淮山茎腐病菌菌丝生长对戊唑醇的敏感性测定

参考刘颖超等［12］的菌丝生长速率法测定茎腐病菌菌丝生长对戊唑醇的敏感性。

将保存的淮山茎腐病各菌株接种于PDA培养基平板上，每菌株至少3板，28℃下

暗光培养5d，选取菌丝生长良好、布满整个培养皿的平板，用打孔器（直径

4mm）打若干个菌饼（各菌饼中菌丝生长速率基本一致）。取适量的戊唑醇母液，

加入溶化后冷却到55℃左右的PDA培养基中，摇匀，制成最终质量浓度梯度为

0.05、0.15、0.25、0.5、2.5μg／mL的含毒 PDA 培养基平板。在无菌操作台上

冷却30min后，用接种针挑取菌饼，倒扣于含毒培养基中央，每皿1个菌饼。28℃

暗光条件下培养6d，采用传统十字交叉法测量每皿中的菌落直径，每处理3皿，

试验重复2次。同时，每菌株设置3皿不含药液的培养基培养作为对照。统计各

质量浓度下菌落生长直径，计算菌丝生长抑制率。菌丝生长抑制率＝（对照菌落生

长直径－处理菌落生长直径）／（对照菌落生长直径－菌饼直径）×100%。查阅

抑制率－几率值对照表，获得几率值，建立几率值（y）和质量浓度对数（x）之

间的毒力回归方程（y＝ax＋b），计算决定系数（R2）和各菌株的抑制中质量浓

度（EC50值）。

1.5 淮山茎腐病菌孢子萌发对戊唑醇的敏感性测定

采用抑制孢子萌发法［13］测定各茎腐病菌菌株对戊唑醇的敏感性。将100μL

（约200个孢子）孢子悬浮液涂布于含有戊唑醇（终质量浓度分别为0.001、

0.005、0.025、0.125、0.625μg／mL）的 WA培养基平板上，并设不含药液的

对照，28℃下暗光培养12h，观察孢子萌发情况，试验重复2次。计算孢子萌发

抑制率，萌发抑制率＝（对照孢子萌发数目－处理孢子萌发数目）／对照孢子萌发

数目×100%。建立萌发抑制率对应几率值（y）和质量浓度对数（x）之间的毒力

回归方程，计算R2和EC50值。

1.6 数据分析

数据统计、排序，建立毒力回归方程，计算R2、EC50值、标准方差和敏感性基

线即平均EC50值等均在Excel程序中进行。对各菌株菌丝生长的EC50值和孢子

萌发的EC50值，在SPSS 19.0统计软件中进行单样本K－S正态性分布检验，判

断是否符合正态分布。同时，分别将菌丝生长的EC50值和孢子萌发的EC50值等

分成7份，统计每份中菌株的个数和频率，在SAS 8.1软件中，以等分值为横坐

标，频率为纵坐标，分别绘制各菌株菌丝生长EC50值和孢子萌发 EC50值的频率

分布图［14］。

2 结果与分析

2.1 淮山茎腐病菌的分离结果

从89份淮山茎腐病茎中分离菌株，纯化后进行单孢分离和鉴定，得到32个淮山

茎腐病菌菌株，编号见表1。

表1 淮山茎腐病菌菌丝生长对戊唑醇的敏感性测定结果菌株 来源 回归方程 R2

EC50值／（μg／mL）菌株 来源 回归方程 R2 EC50值／（μg／mL）LG10－1

临高 y＝1.027 6x＋5.751 9 0.980 5 0.185 481 LG1－2 临高 y＝0.904 1x＋

5.507 1 0.987 7 0.274 900 LP5－3 海口 y＝1.134 0x＋6.069 4 0.981 2 0.114

025 BD6－5 海口 y＝0.808 1x＋5.588 2 0.987 5 0.187 111 DL－5 澄迈 y＝

0.794 7x＋5.596 0 0.973 0 0.177 828 BD6－4 海口 y＝0.944 6x＋5.451 4

0.971 3 0.235 017 BD7－2 海口 y＝0.998 9x＋5.481 4 0.954 6 0.329 686 BD8

－1 海口 y＝1.024 8x＋5.510 9 0.980 1 0.287 806 DL－8 澄迈 y＝1.137 9x＋

5.910 8 0.984 8 0.158 343 BL2－2 海口 y＝0.717 8x＋5.668 3 0.945 7 0.222

792 BD5－2 海口 y＝1.075 8x＋5.913 9 0.956 8 0.141 413 LG16－1 临高 y＝

0.909 3x＋5.859 3 0.973 4 0.108 868 LG8－2 临高 y＝0.762 4x＋5.473 0

0.999 5 0.239 662 LP3－2 海口 y＝1.085 8x＋5.552 8 0.976 5 0.246 661 BL6

－5 海口 y＝1.052 9x＋5.715 8 0.913 5 0.209 007 LG1－1 临高 y＝0.892 2x＋

5.565 1 0.937 4 0.275 613 LG17－1 临高 y＝1.102 4x＋5.513 9 0.958 3 0.341

822 LG2－1 临高 y＝0.875 5x＋5.654 3 0.972 8 0.250 438 DL3－3 澄迈 y＝

1.449 5x＋6.732 5 0.991 4 0.063 797 LP2－4 海口 y＝1.009 7x＋5.607 1

0.975 8 0.275 994 LP8－1 海口 y＝1.179 7x＋5.460 5 0.918 6 0.407 005 BD5

－4 海口 y＝1.088 1x＋5.449 0 0.987 0 0.389 673 LG5－1 临高 y＝0.892 0x＋

5.593 2 0.987 0 0.216 272 LP4－5 海口 y＝1.056 3x＋5.666 5 0.989 8 0.173

261 DL－13 澄迈 y＝0.927 9x＋5.660 1 0.863 7 0.194 357 DL－5 澄迈 y＝

1.097 0x＋5.548 8 0.991 9 0.228 876 BD6－3 海口 y＝0.952 6x＋5.585 1

0.948 3 0.243 108 LP3－1 海口 y＝1.058 1x＋5.607 6 0.989 2 0.265 950 LP9

－3 海口 y＝1.286 9x＋6.110 9 0.971 4 0.137 025 LP4－3 海口 y＝0.857 0x＋

5.490 6 0.985 6 0.343 795 BD7－3 海口 y＝1.208 4x＋5.753 1 0.970 6 0.238

122 LP2－5 海口 y＝1.028 1x＋5.876 4 0.982 8 0.140 475

2.2 淮山茎腐病菌菌丝生长对戊唑醇的敏感性

从表1可以看出：不同菌株对戊唑醇的敏感性差异较大，如EC50值最高为海口云

龙的LP8－1，EC50值为0.407 005μg／mL，而澄迈大拉的DL3－3菌株EC50

值则最低，为0.063 797μg／mL，最大值和最小值之间相差6.38倍。各菌株

EC50值的标准偏差为0.080 5，平均EC50值为（0.228 3±0.080 5）μg／mL。

从图1可以看出，EC50值在0.210 8～0.259 8 μg／mL的菌株数最多，有9个，

其EC50值接近平均EC50值，同时，柱形图也反映出所有菌株的EC50值之间较

连续；在SPSS 19.0统计软件中对EC50值进行单样本K－S正态性分布检验，得

Kolmogorov－Smimov Z＝0.505，渐进连续性P＝0.961，检验分布为正态分布，

EC50值表现连续性，说明这32个淮山茎腐病菌菌丝生长对戊唑醇的敏感性频率

分布符合正态分布。截至目前，淮山茎腐病菌自然种群菌丝生长对戊唑醇无明显的

抗药性。

图1 淮山茎腐病菌32个菌株菌丝生长对戊唑醇的敏感性频率分布

因此，在海南远离内陆这一特殊的地理环境中，对三唑类杀菌剂戊唑醇而言，淮山

茎腐病菌群体基本上还处于原始种群，故本试验中，戊唑醇对菌丝生长抑制的平均

EC50值（0.228 3±0.080 5）μg／mL，可作为海南淮山茎腐病菌对戊唑醇的敏

感性基线。

2.3 淮山茎腐病菌孢子萌发对戊唑醇的敏感性

戊唑醇对淮山茎腐病菌孢子萌发抑制的EC50值介于0.002 550～0.104 858μg／

mL（表2），平均EC50值为（0.031 8±0.024 2）μg／mL。EC50值集中分布

在0.002 550～0.051 928μg／mL，个别孢子萌发的EC50值较高，如LG8－2

孢子萌发的EC50值最高，为0.104 858μg／mL；BD7－2和 LG5－1次之，分

别为0.096 895 μg／mL 和 0.095 411 μg／mL。 而 在0.051 928～0.095

411μg／mL，无其他EC50出现，说明EC50值表现不连续，在高质量浓度区仍

有个别不敏感菌株。

表2 淮山茎腐病菌孢子萌发对戊唑醇的敏感性测定结果菌株 来源 回归方程 R2

EC50值／（μg／mL）菌株 来源 回归方程 R2 EC50值／（μg／mL）LG10－1

临高 y＝1.254 7x＋8.254 1 0.959 0 0.002 550 LG1－2 临高 y＝0.659 5x＋

6.094 6 0.918 0 0.021 893 LP5－3 海口 y＝0.712 5x＋6.171 4 0.929 6 0.028

451 BD6－5 海口 y＝0.633 8x＋5.925 4 0.955 4 0.034 666 DL－5 澄迈 y＝

1.429 2x＋7.833 7 0.924 7 0.010 406 BD6－4 海口 y＝0.625 2x＋6.023 0

0.955 9 0.021 345 BD7－2 海口 y＝0.723 9x＋5.733 8 0.960 0 0.096 895 BD8

－1 海口 y＝0.616 6x＋6.013 6 0.944 1 0.023 922 DL－8 澄迈 y＝0.937 1x＋

6.567 3 0.974 6 0.021 257 BL2－2 海口 y＝0.612 3x＋5.937 9 0.923 3 0.030

123 BD5－2 海口 y＝0.774 0x＋6.118 0 0.958 6 0.035 942 LG16－1 临高 y＝

0.701 0x＋5.744 3 0.927 7 0.051 928 LG8－2 临高 y＝0.761 1x＋5.745 4

0.976 7 0.104 858 LP3－2 海口 y＝0.623 8x＋6.207 1 0.952 4 0.018 967 BL6

－5 海口 y＝0.841 2x＋6.689 7 0.907 5 0.009 802 LG1－1 临高 y＝0.579 4x＋

5.887 8 0.950 4 0.023 966 LG17－1 临高 y＝0.648 1x＋6.094 3 0.979 2 0.020

488 LG2－1 临高 y＝0.616 6x＋5.981 8 0.914 3 0.033 443 DL3－3 澄迈 y＝

0.642 4x＋6.135 1 0.940 3 0.017 113 LP2－4 海口 y＝0.547 9x＋5.895 3

0.954 7 0.036 711 LP8－1 海口 y＝0.620 9x＋5.996 7 0.907 7 0.024 814 BD5

－4 海口 y＝0.665 3x＋5.884 7 0.928 1 0.037 592 LG5－1 临高 y＝0.553 7x＋

5.565 0 0.956 2 0.095 411 LP4－5 海口 y＝0.523 6x＋5.995 9 0.904 4 0.024

261 DL－13 澄迈 y＝0.738 2x＋6.230 7 0.968 5 0.021 518 DL－5 澄迈 y＝

0.620 9x＋6.136 7 0.974 1 0.012 832 BD6－3 海口 y＝0.785 4x＋6.228 3

0.937 8 0.027 290 LP3－1 海口 y＝0.964 3x＋5.890 9 0.973 5 0.019 884 LP9

－3 海口 y＝0.615 2x＋6.063 6 0.940 5 0.018 668 LP4－3 海口 y＝0.600 9x＋

6.976 8 0.853 5 0.045 186 BD7－3 海口 y＝0.671 0x＋6.075 0 0.914 3 0.024

998 LP2－5 海口 y＝0.652 4x＋6.123 2 0.951 1 0.018 985

将所得32个EC50值在SPSS 19.0统计软件中进行单样本K－S正态性分布检验，

得Kolmogorov－Smimov Z＝1.405，渐进连续性P＝0.039＜0.05，检验敏感

性分布不属于正态分布。如图2所示，EC50值表现不连续，在高质量浓度区有拖

尾现象。这一结果表明，在自然菌株群体中，个别自发突变的菌株孢子萌发对戊唑

醇敏感性较差，表现出一定的耐药性。

图2 淮山茎腐病菌32个菌株孢子萌发对戊唑醇的敏感性频率分布

3 结论与讨论

抑制菌丝生长和孢子萌发试验结果表明：海南淮山茎腐病菌菌丝生长和孢子萌发对

戊唑醇的敏感性较高。32个菌株菌丝生长对戊唑醇的敏感性呈正态分布，菌株的

EC50值分布连续，且大多集中在0.210 8～0.259 8 μg／mL，接 近 平 均 EC50

值（0.228 3±0.080 5）μg／mL，因此，该EC50值可作为海南淮山茎腐病菌对

戊唑醇的敏感性基线。但是，个别菌株孢子萌发对戊唑醇具有一定程度的耐药性，

EC50值在高质量浓度区域有拖尾现象。

不同茎腐病菌菌株的EC50值存在差异，对菌丝生长抑制的最小EC50值为0.063

797μg／mL，最大为0.407 005μg／mL，相差6.38倍；而对孢子萌发抑制的

EC50值最小为0.002 550μg／mL，最大为0.104 858μg／mL，相差41.12倍。

这可能与自然环境中茎腐病菌的地理小种差异等生物和遗传特性、不同淮山生产基

地的用药情况以及光温、雨水等复杂的环境条件有一定的关系。王文桥等［15］

报道，病原菌对杀菌剂的敏感性受病菌生物与遗传特性、用药状况及环境条件等因

素的制约。此外，各菌株菌丝生长对戊唑醇的敏感性均低于其孢子萌发的敏感性。

这与李红霞等［16］、Gullino等［17］的研究结果是一致的。李红霞等［16］

对来自江苏和海南的辣椒炭疽病菌进行敏感性测定，发现嘧菌酯抑制孢子萌发的活

性远高于抑制菌丝生长的活性。研究发现，病原菌孢子萌发对线粒体的呼吸作用依

赖性较强，而菌丝在无性生长过程中，对线粒体呼吸作用的依赖性较弱［18］。

这可能是病原菌孢子萌发对药剂敏感性较高的原因。

近几年，淮山茎腐病在海南地区大面积发病，由于目前尚无淮山茎腐病菌对戊唑醇

产生抗药性的报道，为避免或减少抗药性的产生，在实际生产过程中可以将戊唑醇

作为防治淮山茎腐病的替代药剂，与当地生产过程中大量使用的多菌灵和嘧菌酯交

替使用。鉴于茎腐病菌孢子萌发对戊唑醇敏感性较高的特性，可以在发病初期使用

低质量浓度的戊唑醇抑制孢子的萌发，从而有效地抑制病原菌的侵染，防止病原菌

大面积扩散。

参考文献：

［1］赵志祥，陈圆，肖敏，等.几种杀菌剂对薯蓣茎腐病菌的室内毒力测定［J］.

湖南农业大学学报：自然科学版，2013，39（1）：22－28.

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