非编码RNA

生物细胞非编码RNA的调控

Abstract:Epigeneticsisthestudyofmeioticallyandmitotically

heritablechangesingeneexpressionthatarenotcodedforinthe

mepigeneticsisderivedfromepi-

(meaningupon)eticregulationofmammaliangene

expressionhasprofoundeffectsincontrollingcellgrowth,

ortantepigenetic

mechanismsincludeDNAcytosinemethylation,histonemodificationsand

-codingRNAsare

n

classofregulatorynon-codingRNAsincludesiRNA,miRNA,piRNAand

sgrowingevidencethatregulatorynon-

codingRNAsplayesntialrolesintheregulationofgeneexpression

,

wereviewcurrentrearcheffortsa中国建筑风格 imedatunderstandingnon-codingRNA

sandtheirmechanismsoffunctioninmammaliancells.

Keywords:epigenetics;non-codingRNAs;DNAmethylation;histone

modifications;mammaliancells

目前表观遗传学(Epigenetics)通常被定义为基因表达通过有丝分裂或减

数分裂发生了可遗传的改变,而DNA序列不发生改变。

表观遗传学的机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA。

DNA甲基化(DNAmethylation)是指在DNA甲基转移酶(DNA-

methyltransferas,DNMTs)的催化下,CpG二核苷酸中的胞嘧啶被选择性地添

加甲基,形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基转移酶有两种,其中DNMT1主要起维

持甲基化的作用,能使半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶

甲基化,可参与DNA复制双链中新合成链的甲基化;而DNMT3a和DNMT3b主要

起形成甲基化的作用,能在未发生甲基化的DNA双链上进行甲基化。DNA甲基

化一般与基因的沉默相关,DNA去甲基化则与基因的活化相关。组蛋白修饰

(Histonemodifications)是指组蛋白的基础氨基末端尾部突出于核小体,常在

转录后发生变化,包括甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等翻译后的修饰,这些

修饰构成了丰富的“组蛋白密码”(Histonecode),能影响染色质的压缩松紧

程度,因此在基因表达中起重要的调节作用。其中甲基化是组蛋白重要的修饰方

式,多发生于组蛋白H3、H4的赖氨酸(K)和精氨酸(A)残基上,组蛋白赖

氨酸甲基化既可以导致激活,也可以导致抑制,通常取决于它所位于的残基情

况。如H3K9、H3K27和H4K20甲基化一般与异染色质形成有关,是学者们熟

知的重要的“失活”标记物(Hallmark),而“活性”标记物则包括H3K4

及H3K36的甲基化。乙酰化也是组蛋白重要的修饰方式,多发生于N-末端保守

的赖氨酸残基上,如组蛋白H3上的9号和14号赖氨酸残基,H4上的5

号、8号、12号和16号赖氨酸残基,组蛋白H3和H4上赖氨酸的乙酰化与

活化或开放的染色质有关。与此相反,赖氨酸残基经脱乙酰作用导致染色质压缩

和基因的失活。不同的组蛋白修饰之间可以相互影响,并与DNA甲基化相互作

用。非编码RNA(Non-codingRNAs)是指不能翻译为蛋白的功能性RNA分子,

分为看家非编码RNA(Houkeepingnon-codingRNA)和调控非编码

RNA(Regulatorynon-codingRNA),其中具有调控作用的非编码RNA按其大小主

要分为两类:短链非编码RNA(包括siRNA、m涨薪申请 iRNA、piRNA)和长链非编码

RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)(表1)。尽管近年来大量研究表明非编码

RNA在表观遗传学修饰中扮演了重要的角色,能在基因组水平及染色体水平对基

因狮子和处女 表达进行调控,决定细胞分化的命运,但相对于其他生物(酵母、果蝇、

线虫及植物等),哺乳动物细胞中表观遗传学的研究相对滞后。

1siRNA

siRNA来源于长的双链RNA

分子(包括RNA病毒复制子、

转座子或转基因靶点等),

经Dicer酶剪切为21~25nt

的双链RNA片段,装载

至AGO蛋白而发挥作用，近

年研究表明,siRNA能在哺乳

动物细胞中介导DNA甲基化

和组蛋白修饰,从而导致转录基

因沉默(Transcriptionalgenesilencing,TGS)。Kawasak等首先合成

了靶向CpG岛E-cadherin基因启动子的siRNA,通过亚硫酸氢盐修饰结合测

序法(Bisulphitequencing)证实,同源siRNA转染的细胞(人乳腺癌细胞

MCF-7和人正常乳腺细胞),其靶标DNA发生了特异性的甲基化及组蛋白H3K9

的甲基化,而且该沉默依DNMT1/DNMT3b,提示基因沉默发生于转录水平,是由

DNA甲基化引起的。Morris研究结果表明靶向延长因子1(Elongation

factor1alpha,EF1A)启动子的siRNA能够导致TGS,其机制与靶标的DNA甲

基化密切相关,进一步证实了哺乳动物细胞内siRNA介导的TGS的保守性。

表1表观遗传学中起主要调控作用的非编码RNA

种类长度(nt)来源主要功能

siRNA~21~25长双链RNA转录基因沉默

miRNA~21~25含发卡结构的pri-miRNA转录基因沉默

piRNA~24~31长单链前体或起始转录产物等多途径生殖细胞内转座子的沉默

lncRNA>200多种途径基因组印记和X染色体失活

但有实验报道:TGS过程并未发生DNA甲基化,提示DNA甲基化并非参与所

有小RNA介导的TGS,或者是DNA甲基化在暴露于小RNA的过程中发生了变化。

最近Morris实验室的研究结果表明:以siRNA持续作用于人泛素C(Uboquitin

C,UbC)基因启动子至少3d,可导致长期的基因沉默,靶标首先发生组蛋白甲基化,

随后是DNA的甲基化,即靶标DNA甲基化的检出明显迟于组蛋白修饰,这在一定程

度上可以解释并非所有的siRNA介导的TGS中都能检测到DNA的甲基化。同时提

示,相对于组蛋白修饰而言,启动子的DNA甲基化是一个更容易遗传、更长久的

沉默,即DNA甲基化主要在维持长期的基因沉默方面起作用。为探讨哺乳动物细

胞内siRNA介导的TGS机制,Morris等进一步研究了靶标启动子的组蛋白甲基

化、转录的依赖性以及siRNA的双链是否均参与了TGS,实验结果表明siRNA能

引起靶标启动子EF1A区域H3K9和H3K27的甲基化,而且靶向启动子的siRNA中,

只有其21bp的反义RNA链——引导链(Guidestrain)对于TGS是必需的,且

其主动转录需要RNA多聚酶II(RNApolymeraII,RNAPII)的参与。

目前研究表明:Argonautes蛋白家族(AGO1及AGO2),DNMT3a,组蛋白去

乙酰化酶(Histone

deacetyla-1,HDAC-1)和/或Polycomb蛋白家族(Polycombgroup,PcG)

的EZH2(Enhancerofzestehomolog2)参与了siRNA诱导的TGS[30,37~39]。

哺乳动物细胞内有4种AGO,其中主要是AGO1及AGO2参与TGS,AGO1虽然与

AGO2的同源性为80%,但它缺乏一个关键的催化酶,不能有效地

裂解RNA,因此对于AGO1及AGO2的选择可能依赖于小RNA与靶标之间的互

补性[38]。通常完全互补的dsRNA前体诱导的染色质重塑是由AGO2引发,而发卡

状的dsRNA前体诱导的染色质重塑是由AGO1引发[40]。有意义的是,AGO在TGS

中的作用早于靶标启动子的组蛋白甲基化,当靶标沉默态组蛋白修饰(H3K9甲基

化)增加时,AGO-1明显减少,证明AGO1及RNAPII对H3K9的双甲基化是必需的

[37]。

图2siRNA、miRNA及piRNA的生物合成[26,27,58]

a:(人类)siRNA来源于长的双链RNA分子,经Dicer酶剪切为21~25nt

的双链RNA片段,Dicer酶和dsRNA结合蛋白将siRNA二聚体装载至Argonaute

蛋白(AGO2)而发挥作用;b:(人类)miRNA由内源性的生物体基因产生含有发卡结

构的65~70nt长的pri-miRNA,该发卡结构在细胞核内经Drosha-DGCR8复合物

加工产生pre-miRNA。在细胞浆内,pre-miRNA进一步经Dicer酶剪切为miRNA-

miRNA*二聚体(其中miRNA为引导链,miRNA*为信息链),装载至Argonaute蛋

白1(AGO1)而发挥作用。C:(鼠类)piRNA的生物合成尚不清楚。piRNA来源于

单链RNA前体,而且不依赖于Dicer酶。产生的初级正义piRNA倾向于与MILI

结合,在出生前的睾丸、MILI和MIWI2均参与复制周期,在次级反义piRNA中

MIWI2比MILI更为丰富,次级反义p墨镜牌子 iRNA可能直接裂解转座子mRNA。

EZH2作为组蛋白甲基转移酶,在一定程度上能够引起H3K27的甲基化,而

甲基化的H3K27作为

锚点可募集多余的PcG,从而参与沉默态染色质的形成,导致TGS[39]。染色

体免疫沉淀结果表明:

DNMTs与EZH2抑制的基因之间的结合依赖于EZH2的存在;亚硫酸氢盐修饰

结合直接测序结果

也证明EZH2对于其靶向的启动子甲基化是必需的,提示EZH2作为募集DNA

甲基转移酶的平台,参与了DNA的甲基化。研究报道,在某些基因的靶春节的传统故事 标启动子

内DNMT3a能与小RNA发生免疫共沉淀,表明DNMT3a也参与了靶标启动子的

TGS[36]。

总之,TGS的建立与维持需要多种不同的蛋白:通常AGO1、DNMT3a及HDAC-1

对于起始的沉默是必需的,而DNMT1对于维持沉默是必需的[34]。

已知RNAPII参与了小RNA介导的TGS,研究报道RNAPII与AGO1免疫共沉

淀于启动子区域,但

尚不清楚RNAPII是如何发挥作用的。目前研究主要集中为两种模型。第一

种为RNA-RNA模型(图

3A):其主要特征是RNA引导链与家常炖羊蝎子 RNAPII合成的低拷贝转录子结合,从而导

致沉默。近来更多的研究支持这一模型,其中一个关键的实验是应用对siRNA敏

感的INK4/ARF位点的调节域(Regulatorydomain,RD)作为实验平台,研究siRNA

介导的RD染色质重塑,结果显示其重叠转录是靶向转录链而非模板链,而且完全

互补的双链RNA前体及不完全互补的双链RNA前体均可介导异染色质的形成

[41]。另有研究结果表明经RNAPII合成的低拷贝转录子,可被siRNA的引导链识

别,并作为识别域引导沉默复合物至启动子区域导致TGS[29]。以互补的硫代磷酸

酯寡核苷酸(Phosphorothioateoligonucleotides,PS-ODNs)封闭这些低拷贝转

录子,可终止siRNA靶向的启动子沉默。第二种为RNA-DNA模型(图3B):其主要

特征是在转录过程中,RNA引导链与靶标的一条DNA形成二聚体,从而导致沉

默。支持该模型的直接证据包括:RNAPII能与TATAA转录起始点上游松解的核小

体结合,从而参与TGS[42],以及DNMT3b直接参与了siRNA介导的TGS[30]。事

实上,这两种模型并非相互排斥,可能是siRNA参与了不同的功能过程,当siRNA

直接靶向TATAA或RNPII结合位点时,以RNA-DNA方式介导TGS,而大多数情况下

siRNA是以RNA-RNA方式发挥作用。