二型肺泡上皮细胞

维甲酸拮抗丙烯醛损伤肺泡Ⅱ型上皮细胞的作用

程航远;张强弩;朱艳芳;王晨昱;王勇;刘沨;焦宗宪

【摘要】背景：肺泡Ⅱ型上皮细胞是肺泡上皮组织的干细胞，它的损伤和多种肺

部疾病密切相关。有研究显示维甲酸不仅能促进发育期大鼠肺泡的形成，还能促进

肺损伤后的修复，但也有研究表明维甲酸在肺气肿模型的治疗中无明显作用。目的：

探索维甲酸能否拮抗丙烯醛对原代培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤作用。方法：

综合Dobbs等的细胞分离方法并加以改良，从普通雄性SD大鼠肺组织中成功分

离出较高纯度的肺泡Ⅱ型上皮细胞，并行原代培养。应用MTT法检测丙烯醛对肺

泡Ⅱ型上皮细胞活性的影响，流式细胞术检测在丙烯醛及维甲酸作用下肺泡Ⅱ型上

皮细胞的细胞周期变化。结果与结论：MTT检测结果显示丙烯醛作用下大鼠肺泡

Ⅱ型上皮细胞生长明显受抑，而且肺泡Ⅱ型上皮细胞活性与药物浓度成剂量效应关

系。流式细胞仪检测结果显示丙烯醛作用下G1期细胞增加，维甲酸对丙烯醛的拮

抗作用不明显。提示丙烯醛对原代培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞具有明显的损伤作用，

但维甲酸对丙烯醛的拮抗作用不明显，其作用机制还需进一步深入研

究。%10.3969/.2095-4344.2012.50.023

【期刊名称】《中国组织工程研究》

【年(卷),期】2012(000)050

【总页数】6页(P9437-9442)

【关键词】原代培养;肺泡Ⅱ型上皮细胞;分离;纯化;丙烯醛;维甲酸;肺损伤;流式细胞

术;细胞活性;细胞周期

【作者】程航远;张强弩;朱艳芳;王晨昱;王勇;刘沨;焦宗宪

【作者单位】兰州大学基础医学院病理学研究所,甘肃省兰州市730000;兰州大学

基础医学院病理学研究所,甘肃省兰土耳其旅 州市730000;兰州大学基础医学院病理学研究

所,甘肃省兰州市730000;兰州大学基础医学院病理学研究所,甘肃省兰州市

730000;兰州大学基础医学院病理学研究所,甘肃省兰州市730000;兰州大学基础

医学院病理学研究所,甘肃省兰州市730000;兰州大学基础医学院病理学研究所,甘

肃省兰州市730000

【正文语种】中文

【中图分类】R318

0引言

肺泡上皮由肺泡Ⅰ型上皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞构成，其比例约为1∶2，这两

类细胞在功能上和形态上明显不同。肺泡Ⅱ型上皮细胞在数量上比肺泡Ⅰ型上皮细

胞多，但是其所占的肺泡上皮表面面积的比例不足春来了作文 10%[1]。肺泡Ⅱ型上皮细胞呈

立方形，胞浆里面含有板层小体是其基本特征，是鉴别肺泡Ⅱ型上皮细胞的主要依

据[2-3]。肺泡Ⅱ型上皮细胞是肺泡上皮组织干细胞，在正常的细胞更新和损伤修

复过程中它既可以分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞，也可以通过有丝分裂来维持自身细胞

群[4-5]。肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤与多种肺部疾病有密切关系[6-7]，因此研究肺

泡Ⅱ型上皮细胞的病理生理特性具有重要的临床意义。

维甲酸是维生素A的主要活性成分，在体内主要与维甲酸受体结合发挥生物学作

用。有研究显示维甲酸不仅能促进发育期大鼠肺泡房间怎么画 的形成，还能促进肺损伤后的修

复[8]，但也有研究表明维甲酸在肺气肿模型的治疗中无明显作用[9]。

吸烟是导致慢性阻塞性肺病的主要病因，香烟烟雾包含大约1017个氧化剂/自由

基和4700多种化合物，其中丙烯醛是一种活泼的，不饱和醛，在环境中广泛

存在，每支香烟大约产生10-500g丙烯醛，是人体丙烯醛暴露的主要环境来源。

丙烯醛是香烟燃烧所产生的主要有毒物质之一，丙烯醛进入细胞后可直接与DNA

结合形成加合物，导致DNA突变[10]，严重危害人体健康。

本实验参考国内外研究，并对其方法加以改进，从大鼠肺组织中分离出高纯度的肺

泡Ⅱ型上皮细胞，就维甲酸是否拮抗丙烯醛对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞周期的影

响进行实验观察。

1材料和方法

设计：对比观察细胞学实验。

时间及地点：于2011年6月至2012年3月在兰州大学基础医学院病理学研究所

和兰州大学医学实验中心完成。

材料：

实验动物：健康清洁级雄性SD大鼠，鼠龄40-60d，体质量150-180g，由兰州

大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(甘)2005-0007。实验过程中对动物的

处置符合2009年《Ethicalissuesinanimalexperimentation》相关动物伦理学

标准的条例。

维甲酸拮抗丙烯醛损伤肺泡Ⅱ型上皮细胞实验的主要试剂及仪器：

试剂及仪器来源丙烯醛维甲酸、弹性蛋白酶、DNA酶Ⅰ、大鼠IgGBCIP/NBT试

剂盒钢网西亚试剂公司Sigma公司倒置显微镜CO2培养箱酶标仪电子显微镜流

式细胞仪Promega公司北京世纪银丰科技发展有限公司OLYMPUS/CK40

HERA/Cell150POVERWAVE/XJEOLJEM-1230BECKMANCOULTER

EPICS/XL

溶液Ⅰ，溶液Ⅱ：按照Dobbs等[1]的方法配置，溶液Ⅰ含140mmol/LNaCl，

5mmol/LKCl，2.5mmol/L磷酸盐缓冲盐，10mmo杂酱米线 l/LHEPES，6mmol/L葡

萄糖，0.2mmol/LEGTA。溶液Ⅱ含140mmol/LNaCl，5mmol/LKCl，2.5

mmol/L磷酸笔记本声音小 盐缓冲盐，10mmol/LHEPES，2.0mmol/LCaCl2，1.3mmol/L

MgSO4。弹性蛋白酶消化液：用溶液Ⅱ配制，浓度为4.3U/mL；DNA酶Ⅰ溶液

用新鲜PBS液配制，质量浓度为250mg/L。丙烯醛用DMEM配制成浓度分别为

100mol/L、200mol/L、500mol/L的溶液(现配现用)，维甲酸(维甲酸浓度

参考李文斌等[11]的研究结果)先用乙醇配置成浓度为100mol/L的储备液，再

用DMEM稀释成1mol/L的工作液。

方法：

肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离与纯化：按照本实验室已经建立的方法进行操作[12]，具

体介绍如下：清洁级雄性SD大鼠称质量，戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉，

同时腹腔注射肝素钠(40U/kg)使大鼠肝素化。待大鼠麻醉后浸入体积分数70%乙

醇溶液中消毒(注意：勿使大鼠吸入乙醇)，无菌术分离气管做气管插管，剖胸，暴

露心肺。在4.904kPa压力下经肺动脉灌入溶液Ⅱ至肺成苍白色，整体取出心肺。

经气管插管向肺内注入溶液Ⅰ，灌洗8次，溶液Ⅱ灌洗2次，酶消化液灌洗1次。

37℃下经气管插管(0.490kPa)持续向肺内注入酶消化液，消化15min后在含有

4mLDNA酶Ⅰ溶液的培养皿内把肺组织剪碎成1mm3左右的碎块。整个消化过

程保持在20min以内。加入5mLFBS终止消化，把肺组织碎块倾入250mL锥

形瓶内，在37℃往复水浴条件下130r/min摇晃2min。将所得组织碎块和细胞

悬液顺序通过4层用溶液Ⅱ预湿的纱布以及150m，15m和7.5m的滤网。

在整个过程中不提供正负压力，收集滤液1000r/min离心8min，弃上清，用

DMEM调节细胞浓度至(2.0-3.0)109L-1。把细胞悬液接种到包被有大鼠IgG的

塑料平皿中，37℃孵箱孵育1h后轻轻摇晃，移出未贴壁细胞至细胞培养瓶内

37℃孵箱孵育20min，重复3次。移出未贴壁细胞，1000r/min离心8min

后弃上清，用DMEM完全培养基(含体积分数20%胎牛血清的DMEM液)重悬细

胞，把细胞悬液接种到细胞培养瓶内放入37℃孵箱培养。

活细胞计数：细胞纯化完成后取100L细胞悬液与100L0.微笑的作用 4%锥虫蓝溶液混合

后，滴加到血球计数板中，显微镜下观察，细胞未着色、发亮的为活细胞，被锥虫

蓝着色的为死细胞，数500个细胞，计算存活细胞百分比。

倒置相差显微镜观察：细胞培养36h后换液，去除未贴壁细胞，倒置相差显微镜

下观察细胞生长状态，并拍照记录。

透射电镜观察：细胞纯化、离心后去上清，1%戊二醛固定，丙酮脱水，环氧树脂

浸透包埋，超薄切片，柠檬酸铅染色电镜观察、拍片记录。

丹宁酸染色：参照Dobbs[3]的方法，细胞爬片风干后用新配置的PBS洗3遍，

用1%戊二醛固定液固定15min，用PBS冲洗2遍，每次10min，然后固定在

1%的四氧化锇溶液中2h，PBS洗3遍，每次10min，用新鲜配置的1%单宁酸

(pH6.8)染色过夜，用PBS冲洗风干后中性树胶封固。

MTT法检测丙烯醛对肺泡Ⅱ型上皮细胞活性的影响，并确定最佳干预浓度：细胞

纯化后，调整细胞悬液浓度为1106并接种到96孔培养板。待36h后分别设空

白对照组、阴性对照组和不同丙烯醛浓度组(500，200，100mol/L)，每组设4

个复孔分别与培养3，12，24h时弃培养基，在孔内加入20L5g/L的MTT，

放入体积分数5%CO2培养箱内继续培养4h。

取出96孔培养板，每孔加入150LDMSO，气浴恒温振荡器内避光轻轻摇晃10

min，用酶标仪570nm波长检测吸光度(A)。

计算细胞生长抑制率，计算不同浓度药物干预下细胞受抑制情况，然后选择最佳丙

烯醛干预组，以备后续试验。

流式细胞仪检测细胞周期：分别取阴性对照组、丙烯醛干预组(根据MTT检测结果，

选择丙烯醛浓度为200mol/L，作用时间为3h)、丙烯醛加维甲酸组、维甲酸组

细胞各1瓶，用0.25%胰酶消化细胞，收集细胞悬液1000r/min离心弃上清，

沉淀用4℃PBS洗2遍，体积分数70%乙醇4℃固定12h以上，离心弃上清，

沉淀用4℃PBS洗2遍，加入1mLPI染液，常温避光孵育30min，上流式细

胞仪检测细胞周期。

主要观察指标：MTT实验观察各组细胞A值，流式细胞术分析不同细胞周期各时

相细胞所占的百分比。

统计学分析：统计学处理者为第二作者，采用SPSS13.0软件对实验数据行单因

素ANOVA分析。

2结果

2.1活细胞计数结果细胞经黏附纯化后所得细胞悬液，每只大鼠可获得(37.4-

50.9)106个细胞，细胞活性≥90%(锥虫蓝染色)。

2.2倒置显微镜下观察结果原代培养36h后，细胞呈岛屿状或单个生长，细胞形

状呈不规则三角形，胞浆内有空泡状结构、可见丰富粗颗粒，见图1。

2.3透射电镜观察结果细胞纯化后离心，做透射电镜标本，可见肺泡Ⅱ型上皮细

胞胞浆内有多个板层小体，有些板层小体呈内容物排空状，细胞膜上有突起呈绒毛

状结构，见图2。

2.4单宁酸染色结果细胞爬片36h后染色，均明显可见肺泡Ⅱ型上皮细胞胞浆内

有黑色颗粒——板层小体，计算细胞纯度≥90%，见图3。

2.5MTT法检测细胞活性MTT法检测结果显示，丙烯醛作用3h后，肺泡Ⅱ型上

皮细胞活性与药物浓度成剂量效应关系，见图4。

Figure1Obrvationunderinvertedmicroscope：After36hculture,

alveolarepithelialcellstypeⅡprentedanisland-likegrowingfeature

(100)图1大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞倒置显微镜下观察结果(100)

Figure2Obrvationu六年级作文450字 ndertransmissionelectronmicroscopy：Abundant

typicallamellarbodiescouldbefoundinthecytoplasmofalveolar

epithelialcellstypeⅡ(8000)图2大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞透射电镜观察结果

(8000)

Figure3Tannicacidstainingshowedthatagreatamountofgranules

(typicallamellarbodies)inthecytoplasmofalveolarepithelialcellstypeⅡ

werestainedblack(400)图3大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞单宁酸染色结果(400)

2.6流式细胞仪检测细胞周期见图5。

Figure4CellviabilityofalveolarepithelialcellstypeIImeasuredbyMTT

methodaftertreatmentwithdifferentconcentrationsofacrolein(100,

200,500mol/L)图4在100，200，500mol/L丙烯醛_作用3h后MTT法检

测大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞活性(s)

Figure5CellcycleofalveolarepithelialcellstypeⅡdetectedusingflow

cytometry图5流式细胞仪检测大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的细胞周期

图5可见，和阴性对照组相比，丙烯醛干预组肺泡Ⅱ型上皮细胞G1期细胞百分比

明显增加。

维甲酸与丙烯醛共同干预组显示，维甲酸拮抗丙烯醛的效果不明显，肺泡Ⅱ型上皮

细胞G1期细胞百分比与丙烯醛干预组相比差异无显著性意义。

维甲酸组与阴性对照组相比G1期细胞百分比没有明显变化。

3讨论

虽然有很多关于肺泡Ⅱ型上皮细胞的细胞系，但是都不完全具备肺泡Ⅱ型上皮细胞

的表型特征，故原代分离和培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞较为理想。本实验世界杯对战表 室主要综合

了Dobbs等[1-3]的分离方法并加以改良，用普通成年雄性SD大鼠，成功分离出

了较高纯度的肺泡Ⅱ型上皮细胞，能够满足本实验需要，且本方法简便易行，是对

肺泡相关疾病进行体外研究的理想实验材料。

在实验中作者尽可能缩短冲洗时间，从开胸到取出肺组织总时长控制在二三分钟以

内。消化是肺泡Ⅱ型上皮细胞从肺组织分离的关键步骤，用4.2U/mL的弹性蛋白

酶消化肺组织，作用时间控制在20min以内，消化作用较好，分离出的细胞活性

大纯度高。细胞纯化方法很多，主要有密度梯度离心法、免疫黏附法、免疫磁珠法、

差速贴壁法、滤膜分离法及流式细胞仪筛选法等。采用免疫黏附法去除中性粒细胞、

淋巴细胞和巨噬细胞，是可靠简便的方法，结合差速贴壁法和纱布钢网过滤，可大

幅度提升细胞的纯度。继续培养36h后换液，此时大部分细胞呈岛屿状生长，故

可方便地去除混入的血细胞成分，从而进一步提高细胞纯度。通过电镜观察板层小

体是检测肺泡Ⅱ型上皮细胞的金标准，但由于价格昂贵且设备不易普及等因素而限

制了其应用。单宁酸染色法简单易行，特异性高，染色后可直接在光镜下观察到黑

色颗粒，可以用来鉴别细胞并计算细胞纯度。

众所周知，吸烟是导致慢性阻塞性肺病的主要病因[13]，全球80%-90%的慢性阻

塞性肺病是由于吸烟所致[14]。香烟烟雾包含大约1017个氧化剂/自由基和4

700多种化合物，其中丙烯醛是一种活泼的，不饱和醛，在环境中广泛存在，

香烟烟气中含有大量丙烯醛，每支香烟大约产生10-500g丙烯醛[15]，是人体

丙烯醛暴露的主要环境来源。丙烯醛是香烟燃烧的主要产物之一，具有亲电子活性，

进入细胞后可直接与DNA结合形成加合物，导致基因突变[16]。

本实验发现丙烯醛在极低浓度(200mol/L)下即可导致肺泡Ⅱ型上皮细胞活性明

显下降，流式细胞仪检测G1期细胞百分比明显升高，说明丙烯醛抑制大鼠肺泡Ⅱ

型上皮细胞生长，并使细胞周期阻滞在G1期，同时观察了维甲酸对香烟烟雾组份

丙烯醛刺激下原代培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的干预效果，结果显示维甲酸对丙

烯醛的拮抗作用微弱，没有起到保护的效果，其作用环境及机制还需进一步深入研

究。

人们所熟知的类维生素A，包括视黄醇(维生素A)和维甲酸，能够在多种器官中通

过调节形态发生，细胞增殖和分化而发挥作用。在呼吸系统中，有证据表明维甲酸

能够影响与肺脏发育、成熟，以及受损伤以后为维护肺组织结构的完整性而进行的

修复相关的一系列进程[17]。

有研究表明全反式维甲酸能够改善地塞米松诱导的出生后肺泡间隔形成障碍从而挽

救大鼠和小鼠的肺脏功能，也有实验指出在弹性蛋白酶或香烟烟雾诱导的肺气肿模

型小鼠或大鼠体内，反式维甲酸能够使消失的肺泡间隔通过再生而重建，然而，亦

有大量的研究没能发现反式维甲酸在其他一些肺气肿模型中具有保护性作用，且目

前为止仍未发现其在患者身上有明显的保护性作用，出现这种分歧的原因仍不清楚

[18]。

致谢：感谢兰州大学医学实验中心对本实验的大力协助。

4参考文献

[1]DobbsLG,ionandcultureofpulmonaryalveolar

-Liss,Inc.2002;279-

300.

[2]DobbsLG,GonzalezR,ovedmethodforisolating

espirDis.1986;134(1)：141-

145.

[3]

Physiol.1990;258(4pt1)：134-147.

[4]GeirT,JarreauPH,AtabaiK,eukin-1baugmentsinvitro

siolLungCellMolPhysiol.2000;279(6)：

1184-1190.

[5]ology.2006;11Suppl：

S12-5.

[6]Folkesson10年后的自己 HG,NitenbergG,OliverB,lationofalveolar

epithelialfluidtransportaftersubacutelunginjuryinratsfrombleomycin.

AmJPhysiol.1998;275(3pt1)：478-490.

[7]QianZF,GuoXX,ikeDaxueXuebao.1995;20(1)：13-15.

钱仲棐,郭晓璇,戚以谟.吸入石英粉尘对大鼠肺泡II型上皮细胞的影响[J].湖南医科

大学学报,1995,20(1)：13-15.

[8]GuoYL,MaJ,XuJL,uoXinyaoyuLinchuangZazhi.

2009;28(3)：204-208.郭亚丽,马晋,徐建林,等.维甲酸对大鼠肺气肿模型肺组织中

MMP-12,TIM-2及TNF-表达的调节[J].中国新药与临床杂志,2009,28(3)：

204-208.

[9]RothMD,ConnettJE,D’ArmientoJM,ilityofretinoidsfor

.2006;130(5)：1334-1345.

[10]KozekovID,NechevLV,MoleyMS,erchaincross-links

mSoc.2003;125(1)：50-

61.

[11]LiWB,ChangLW,ZhuHP,ixueyuLinchuang.2005;25(2)：

141-145.李文斌,常立文,祝华平,等.维甲酸下调高氧暴露下胎鼠肺成纤维细胞及Ⅱ

型肺泡上皮细胞MMP22表达[J].基础医学与临床,2005,25(2)：141-145.

[12]JiaoZX,ChengHY,ZhangQN,uoZuzhiHuaxueyuXibao

HuaxueZazhi.2012;21(3)：240-244.焦宗宪,程航远,张强弩,等.大鼠肺泡II型

上皮细胞的原代分离[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2012,21(3)：240-244.

[13]RabeKF,HurdS,AnzuetoA,InitiativeforChronic

strategyforthediagnosis,management,

andpreventionofchronicobstructivepulmonarydia：GOLD

pirCritCareMed.2007;176：532-555.

[14]SussanTE,RangasamyT,BlakeDJ,ingNrf2withthe

triterpenoidCDDO-imidazolideattenuatescigarettesmoke-induced

tlAcadSciUSA.

2009;106(1)：250-255.

[15]FengZH,HuWW,HuY,inisamajorcigarette-relatedlung

canceragent：Preferentialbindingatp53mutationalhotspotsand

tlAcadSciUSA.2006;103：15404-15409.

[16]KimSI,PfeiferGP,mutagenicityofacrolein-

Res.2007;67(24)：

11640-11647.

[17]siol.1992;262：L517-L527.

[18]SeifartC,MuyalJP,PlagensA,-transretinoicacidresultsin

irregularrepairofptaandfailstoinhibitpr2017年属 oinflammatorymacrophages.

EurRespirJ.2011;38(2)：425-439.