硝酸还原酶

广西植物Guihaia 24

(

4

)

:367-372 2004年7月

硝酸还原酶活性的调节及可能机制的研究进展

张 涛1,陈 云2,谢 虹2,梁建生23

(

1.扬州大学农学院,江苏扬州225009;2.扬州大学生物科学与技术学院,江苏扬州225009

)

摘 要:氮素是农业研究的重点,硝酸还原酶是氮代谢中的一个关键酶。有关硝酸还原酶的研究一直是植物

生理生化研究的重点。该文就近年来有关硝酸还原酶活性调节的可能机制的研究进展作了简要的综述。

关键词:硝酸还原酶;蛋白激酶;磷酸酯酶;142323蛋白

中图分类号:Q945 文献标识码:A 文章编号:100023142

(

2004

)

收稿日期:2003203224 修订日期:2003209224

作者简介:张涛(

19792)

,男,山东威海人,硕士研究生、植物学专业。3为通讯作者

Therearchprogressoftheregulationofnitrate

reductaactivityandthepossiblemechanism

ZHANGTao1,CHENYun2,XIEHong2,

LIANGJian2sheng23

(

11CollegeofAgriculture,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China;21CollegeofBiological

ScienceandTechnolog,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China

)

Abstract:dyofnitratereducta,whichisakeyenzyme

inthemetabolismofnitrogen,ticlesummarizestherearchprogressofthe

regulationofnitratereductaactivityandthepossiblemechanisminrecentyears.

Keywords:nitratereducta;proteinkina;phosphorylation;142323protein

硝酸还原酶(

nitratereducta,NR,EC.1.6.6.

1/2

)是氮代谢过程中的一个重要的调节酶和限速

酶。在植物的根和叶中都有该酶的存在,它是一种

可溶性的钼黄素蛋白,由黄素腺嘌呤二核苷酸

(

FAD

)、细胞色素b

557

和钼等辅助因子组成。研究

表明,NR催化的反应不是唯一的,它能够催化2个

电子从NAD

(

P

)

H+H+至NO

3

-,使后者转变为

NO

2

-;还可以催化一个电子从NAD

(

P

)

H+H+至

NO

2

-生成NO

(

Yamasaki等,1999

)

;还有报道NR

能催化1个电子从NAD

(

P

)

H+H+至O

2

生成超氧

自由基(图1

)(

Barber和Kay,1996;Yamasaki和

Sakihama,2000

)。

在正常情况下,还原NO

3

-为NO

2

-的反应是硝

酸还原酶催化反应的主流,反应在细胞质中进行。

NR催化NO

2

-生成NO的反应只占催化NO

3

-还

原能力的很小百分比(约1%

)

,尽管产生NO的量

很少,但其对植物的一些生理活动有着重要的调节

及影响,RadhikaDesilan等发现,NR催化NO

2

-产

生的NO在ABA诱导气孔关闭的过程中有重要的

作用,通过对ABA钝感型等突变体的研究发现,NR

催化的NO的生成是ABA诱导气孔关闭所需的。

但是NO在其他生理活动中的作用机理尚不清楚

(

Kair和Huber,2001

)。

1 硝酸还原酶的组成

研究发现,高等植物的NR似乎是由相同亚基

组成的二聚体,每个亚基含有3个辅助因子,即

FAD、血红素(细胞色素b

557

)和钼辅因子(

MoCo

)。

每个辅因子相当于一个氧化还原中心。MoCo是一

个取代的喋呤基(又称钼喋呤)

,含有由两个硫配体

结合的钼。用限制性内切酶对菠菜NR进行酶切,

发现二聚体结构的分子具有75KDa含钼的区域,

血红素辅基与14KDa区域相联系,而FAD辅基包

含在28KDa的区域,3个区域似乎通过铰链区域

(

hinge

regions

)连接。通过对高等植物NR的克隆

和序列分析得知:MoCo结合区域位于蛋白质N2末

端,血红素结合区域位于蛋白质的中心区域,FAD

结合区域位于蛋白质的C2末端。后来得知,NR分

子中电子的传递途径是NAD

(

P

)

H+H+→FAD→

细胞色素b

557

→钼喋呤→硝酸盐(宋松泉等,1993;

Ahmad和Abdin,1999

)。

在大多数高等植物中,NR以NADH为电子供

体,这种NR对NO

3

-有相对低的Km值。而在水

稻幼苗、大豆等植物中,NR可以从NADH+H+或

NADPH+H+得到电子,并且以NADPH+H+为电

子供体时活性较高。Ahmad等(

1999

)发现芥菜幼

苗期,当营养液中的NO

3

-浓度较低时,以NADH

为电子供体的NR催化占主导,随着NO

3

-浓度的

升高,以NADPH为电子供体的NR催化占据了主

导作用。

2 硝酸还原酶活性调节机制

2.1硝酸还原酶的活性状态

NR对环境条件十分敏感,光、NO

3

-含量、CO

2

浓度等均会影响其活性。例如菠菜由光下移至暗中

几分钟后,其叶片NR便明显地失活,而NR蛋白的

合成或降解无法在如此短时间内达到这样的结果

(

Kair和Forster,1989

)。可以设想,植物体内存在

一种机制,能快速准确地调控NR的活性以适应环

境条件的改变。这种改变可能只是NR蛋白自身的

改变,并没有涉及到转录或翻译水平。用凝胶柱层

析的方法除去粗酶液中的小分子化合物后,NR仍

可以保持相当的活性,这说明该酶不是变构调节

(

allostericmodulation

)

,其活性的改变是由于NR蛋

白的修饰而实现的,由此推测最有可能的机制是蛋

白的氧化/还原或蛋白的磷酸化/去磷酸化,由于还

原剂二硫苏糖醇(

DTT

)或氧化剂过氧化氢对NR的

活性影响不大(

Kair和Huber,1994

)

,因而得知

NR活性的调节不是由蛋白的氧化/还原引起的。

通过32P标记技术,发现菠菜NR蛋白在Ser

543

可以

被磷酸化,并引起NR的失活。后来又发现,磷酸化

不是NR失活唯一的原因,它还需要额外的蛋白的

参与(

Kair和Huber,2001

)

,这类蛋白即142323蛋

白家族。在有毫摩尔每升浓度级的游离Mg2+存在

的情况下,142323蛋白(

142323s

)与NR的磷酸化位

点结合,从而导致NR失活(

Aitken,1996;Moorhead

等,1999

)。所以推测细胞中NR可能存在3种状

态:①自由的NR

(具有酶活性)

;②被磷酸化的NR

(

pNR,具有酶活性)

;③142323s结合的磷酸化NR

(

pNR:142323s,无酶活性)(

Kair等,2002

)。以上

三种状态的NR的比率是可变的,且主要是由环境

因素决定的,当外界条件例如光、NO

3

-、CO

2

等发生

改变时,三种NR活性状态的比率会发生可逆而迅

速的变化,现在认为这是暗处理一段时间后,菠菜叶

片中NR快速地失活的主要原因。

2.1.1142323蛋白家族 142323s是起广泛调节作用

的一类蛋白。最先发现142323s是存在于动物中的

含量丰富、酸性的、可溶性的脑蛋白,其分子量为25

～32kDa。但随着植物领域的进一步研究,发现在

所有的已研究的真核生物器官中均有142323s家族

成员的存在,Ronquist等列出在48个品种中有

153种该类蛋白。142323s有着高度的序列一致性,

即使在不同的品种内,它也可以对靶蛋白起作用。

142323s一般是通过与目标蛋白结合而起作用的,目

标蛋白通常会有磷酸化位点,142323s可以识别该位

863

广 西 植 物 24卷

点,结合后起到调节的作用。Muslin等发现142323s

识别的位点通常有RSXpSXP序列(

X表示任意一

种氨基酸,pS表示磷酸化的Ser。)(

Muslin等,

1996

)

,当然142323s还可以与其他的磷酸化片断或

非磷酸化片断结合(

Masters等,1999

)。

在高等植物中,142323s可以调节众多的生物代

谢过程,甚至在拟南芥中,由于142323s的这种广泛

调节作用,又称之为广泛调节因子(

GRFs

)(

Rooney

和Ferl,1995

)。142323s能够调节蛋白激酶C的活

化(

Toker等,1990

)

,通过植物质膜H+2ATP酶调节

质子泵(

Oecking等,1994

)

,调节植物代谢过程中的

关键酶(

Bachmann等,1996;Toror等,1998

)

,如在

氮代谢过程中,它可以改变NR和谷氨酰胺合成酶

等的活性状态。

2.2硝酸还原酶活性状态转换的可能机制

有研究表明,NR可以在MoCo区域与血红素

区域之间的铰链区域被磷酸化,从而产生了一个可

与142323s结合的位点(

Bachmann等,1996

)。当有

毫摩尔每升浓度级的游离Mg2+存在时,142323s结

合到pNR上,使之失去活性。当没有Mg2+存在时

(加入EDTA

)

,所有的NR处于活性状态(

100%

)

,

当存在Mg2+时,NR活性为实际活性状态(

x%

)。

NR活性状态的转换可以表示为图2

(

Kair和Hu2

ber,2001

)。

2.2.1硝酸还原酶的磷酸化与去磷酸化 用阴离子

交换色谱分析菠菜的叶片提取液,可以测得数个

NR激酶(

PK

)峰,这些激酶可以磷酸化NR的Ser

543

位,并产生142323s结合位点。一种激酶是SNF1相

关酶(

SnRK1

)(

Subden等,1999

)

,这种酶本身可能

被代谢物抑制。另外两种激酶属于CDPKs

(

Calci2

um2dependentproteinkinas

)。现在还不清楚

SNF1相关酶或CDPKs是如何磷酸化NR或如何通

过其它信号调控NR的,但暗中叶片细胞内Ca2+浓

度伴随NR磷酸化、失活的同时而升高的现象可能

提供一条研究线索(

Miller和Sanders,1987

)。

pNR的去磷酸化是由磷酸酯酶2A催化的

(

PP2A

)

,它主要存在于胞浆内,但现在对植物中该

酶的结构及组成所知不多,仅知道其作用于pNR的

活性也受代谢物的调节。另有研究发现,去磷酸化

并非活化NR的唯一途径(

Mackintosh和Meek,

2001

)

,一些小分子,包括磷酸盐、EDTA和AMP也

能活化NR

(

Aguera等,1999;Kair等,1992

)。而

图2 NR的活性状态及参与分子

Fig.2 NRactivitystateandtherelevantmolecules

PK催化NR的磷酸化,PP催化NR的去磷酸化。NR的

磷酸化状态并不失去活性,但由于NR的磷酸化,

使得142323s能够在Mg2+存在的条件下与

pNR结合,最终导致NR的失活。

NRcanbephosphorylatedbyPKanddephosphorylated

eexistenceofMg2+,142323scan

stateofpNR:142323shasnoactivation.

142323s与pNR结合后会阻碍pNR的去磷酸化,因

为142323s结合后的pNR的去磷酸化比pNR的去

磷酸化速度更缓慢(

Bachmann等,1996

)。Bach2

mann等人认为142323s使NR的去磷酸化减缓的原

因是使NO

3

2

的还原减慢,从而光合作用能够提供

NH

4

+转化为氨基酸所需足够的碳骨架。还有人认

为142323s与NR结合后会稳定NR的磷酸化状态,

阻止去磷酸化。

蛋白激酶的作用与其底物ATP水平有关,缺氧

条件下,组织中ATP水平下降,NR被活化,这可能

963

4期 张 涛等:硝酸还原酶活性的调节及可能机制的研究进展

是NR磷酸酯酶的作用超过NR激酶的作用(

Glaab

和Kair,1993

)。总之,在一般情况下,蛋白激酶和

磷酸酯酶的共同作用使得NR和pNR处于动态的

平衡,该平衡会被外界因素快速地调节。

2.2.2142323蛋白与硝酸还原酶的结合 现在我们

已经清楚142323s在植物及真菌等生物体中起重要

的调节作用(

Aitken,1996

)。天然存在的NR分子

与142323s结合的位点是在第一铰链区域可被磷酸

化的Ser

543

附近的序列(

Bachmann等,1996

)。14232

3s与pNR结合后引起NR失活的原因可能是使

NR的空间结构发生改变,进而导致MoCo区域与

血红素区域间的电子传递无法进行(

Kair和Hu2

ber,2001

)。Weiner和Kair

(

1999

)利用突变体的

研究发现,每个NR分子可以与2个142323s结合,

于是推测NR分子上可能存在另外一个142323s结

合位点(

Pigaglio等,1999;Weiner和Kair,2001

)

,

142323s与该位点结合的作用可能是稳定NR的磷

酸化状态,另外还有研究证明除了Ser

543

位点,NR

的N末端也参与了142323s的结合。

当有二价阳离子存在时,142323s与磷酸化片段

的连接会得到促进(

Athwal等,1998

)。Provan等发

现,要想分离出142323s结合的烟草pNR,必须要有

游离Mg2+的存在(

Sugden等,1999

)

,这进一步证实

了只有毫摩尔每升浓度级的游离Mg2+时,142323s

才会与pNR结合并使之失活的说法。在光/暗转换

的条件下,Mg2+的存在会明显改变NR活性。

Kair等(

2001

)推测金属阳离子在NR活性调节中

可能起以下几个作用:

(

1

)蛋白激酶本身是一个Ca

离子依赖酶;

(

2

)蛋白激酶的底物是Mg2+2ATP;

(

3

)

金属阳离子是使pNR2142323s复合体失活所必需

的。但至今仍不清楚金属阳离子是在142323s与

pNR结合中所必需的,还是pNR2142323s复合体失

活中所需的,或者起到以上二者作用(

Weiner和

Kair,1999

)。

由上文所述,NR的三种活性状态中只有14232

3s结合pNR态无活性,所以142323s的结合与否很

重要。有试验证明,营养条件、激素均可能对14232

3s进行翻译后调节,从而改变142323s与pNR的结

合比例,进一步调节NR的活性(

Mackintosh和

Meek,2001

)。另外,142323s是一类起广泛调节作

用的蛋白家族,pNR不是它们的唯一受体,细胞内

142323s含量远高过NR的量,二者要想结合,pNR

必须要和可与142323s结合的磷酸化片段竞争,该竞

争也在NR的活化/去活化过程中起一定的调节作

用(

Camoni等,1998

)。

在NR参与磷酸化失活的位点的研究中,早先

发现马铃薯NR的N2末端参与了该酶磷酸化失活

的过程。Pigaglio等(

1999

)发现NR蛋白的N2末端

氨基酸去除后,较野生型对热更为敏感,但是相应的

对黑暗条件下的磷酸化去活不敏感,而且缺失N2末

端的突变体不会受光/暗交叉处理的影响。在菠菜

中,当蛋白质水解NR使之失去前45个氨基酸时,

NR活性不再因142323s的结合而失活尽管它仍会

被磷酸化。这表明,NR的N2末端区域在一定程度

上参与其磷酸化失活的过程。Provan等的研究结

果与Pigaglio有所不同,在有Mg2+和磷酸酯酶抑制

剂存在的条件下,NR与内生142323s通过层析可以

共分离。NR活性的测定与蛋白质杂交表明内生

142323s可以与野生型NR和突变体NR共同分离。

突变体NR的电子传递在亚铁血红素结合区域被

Mg2+/142323s抑制,而在野生型NR中不存在这种

现象,这可能是142323s与野生型NR和突变体NR

的结合形式不同。而且认为NR的不稳定性与钼喋

呤所在的部位有关,N末端的56位氨基酸可能与钼

喋呤的稳定性有关(

Bachmann等,1996

)。

2.3蓖麻Ricinuscommunis中硝酸还原酶活性调节

就现研究的高等植物中,绝大部分NR活性的

调节是通过NR、磷酸化NR、142323s结合的磷酸化

NR三者之间的转换而实现的,但也有例外,Ricinus

communis的叶片和根中的NR活性调节机制就与

其它高等植物不同。据Kandlbinder等(

2000

)的研

究,在pH7.6且有5～10mMMg2+存在的条件下,

Ricinus的NR活性极低,光下与暗中的差别也不

大,但在EDTA存在的条件下,最大NR活性是正

常的。但当调节pH低于7时,提取液中NR活性

快速提高,调节pH大于7.3时,NR活性又变得极

低。其原因可能是在不同pH值条件下,NR对

Mg2+的敏感度相差很大,在生理pH值下,Ricinus

对Mg2+较其它高等植物更敏感。

用免疫研究技术进一步研究蓖麻NR活性调节

的机制,发现其NR的Ser磷酸化位点和142323s结

合修饰是与其它植物相同的,所以关于RicinusNR

活性的调节机制仍然没有明确的答案。只是推测

NR分子上存在重金属离子结合位点,金属离子如

Zn2+的结合会引起NR的失活(

Campbell,1999

)

,该

结合位点的序列可能会发生改变,使得Mg2+亦可

073

广 西 植 物 24卷

与之结合,pH值的改变可能引起NR重金属结合位

点序列发生改变,使得NR对Mg2+的敏感性提高,

从而调节酶的活化/失活。

3 硝酸还原酶的降解

NR的半衰期很短,仅为几小时,所以细胞内

NR的含量不仅决定于NR的合成速率,还决定于

NR的降解速率。光下NR的合成高于暗中,35S标

记的NR在暗中的降解速率快于在光下(

Weiner和

Kair,1999

)。Kair和Huber通过蛋白质杂交技

术发现,黑暗处理菠菜时,去磷酸化会减缓其叶片中

NR的降解。他们还发现,NR蛋白磷酸化酶不仅控

制NR的催化活性,而且是NR降解过程中的信号,

磷酸化的NR更易被降解。后来,有人用人工手段

使黑暗处理中的叶片NR恢复活性后,发现NR蛋

白量处于较稳定的状态,这表明非活性态的NR比

有活性的NR更容易被降解(

Kair等,1999

)。由

此可以推测NR降解的一个重要前提是142323s与

pNR的结合。Weiner等推测,142323s在NR的降

解过程中起到以下三点作用:

(

1

)促进NR的失活;

(

2

)阻止pNR的分裂;

(

3

)引发NR的蛋白水解。

Cotelle等(

2000

)却发现在缺少糖的情况下,

Arabidopsis的细胞内NR及其它蛋白失去了14232

3s的结合位点,如果按上述观点,则NR实际活性会

增强,但事实与之相反,NR快速地被降解。于是推

测可能存在另一种完全不同的蛋白酶,它由于糖缺

乏而产生,其作用底物是未结合142323s的NR。而

在糖充分的条件下,并无上述情况发生。至今仍不

清楚细胞内高糖含量、高NR活性状态、高NR稳定

性之间是相互关联还是有因果关系。

4 结语

关于NR活性调节的研究已由过去的生理水平

逐步深入到分子水平。随着研究的深入,人们发现

NR能催化数种反应。它催化NO

2

-生成的NO在

植物体内可能起一定的信号作用,但此反应受哪些

内外条件的调节,生成的NO在植物体内又如何起

作用,其作用是在特定条件下产生还是一直有产生,

这些将是今后研究的一个重点。另外,尽管对NR

的翻译后调节已经有一定程度的了解,但仍有许多

问题要解决:影响NR活性的因素是否能够调节

NR降解酶、是否与NR的降解有直接关系,NR降

解过程中是否还有其他一些物质起作用。影响NR

活性的因素中,光是如何起作用的,其作用是直接的

还是间接的,与糖含量有无关联。我们发现干旱、氮

素浓度的高低对NR活性有着很大的影响(待发)

,

这种影响是直接的还是间接的还有待进一步研究。

在NR翻译后调节过程中,142323s本身的调节机制

与其和pNR的结合有何联系,pNR和其他磷酸化

片段与142323s结合的竞争机制如何。重金属离子

在NR活性调节过程中起何种作用等等。虽然仍有

很多问题需要解决,但随着多种突变体的得到,分子

生物学技术及免疫技术的深入应用,又将使NR的

研究进入一个全新的领域。

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广 西 植 物 24卷