核蛋白

核蛋白提取

精品资料

实验准备：

14℃离心机

2根据标本数计算所需I，II，III，IV总体积，取出液体，并加入蛋

白酶抑制剂，（III由加蛋白酶抑制剂I与加蛋白酶抑制剂II混合物）

实验操作：

1收集细胞。10ml对照细胞（1-2*105/ml）培养48h后，15ml离心

管收集，300g（1370rpm）*5min。弃上清，加1ml1*PBS轻轻涡

旋混匀后转移至1.5mlEP管。

24℃，300g*5min，弃上清。

3重悬细胞于120μl缓冲液I。

4重悬细胞于120μl缓冲液II，4℃轻微旋转混匀，15min。

54℃2500rpm*1min。

6转移上清（胞浆蛋白）至新管。

7在沉淀中缓慢加120μl缓冲液III，轻微颠倒混匀，离心：4℃，2500

rpm*1min。

8弃上清，加130μl缓冲液IV（+蛋白酶抑制剂），4℃旋转混匀1h。

9离心4℃，13000g*10min。

10转移上清（核蛋白）至一新管，定量。

核提取缓冲液I（15ml）

25mMHEPES375μlHEPES

5mMKCl75μl1MKCl

精品资料

0.5mMMgCl27.5μl1MMgCl2

DDH2O14.54ml

核提取缓冲液II（15ml）

25mMHEPES375μlHEPES

5mMKCl75μl1MKCl

0.5mMMgCl27.5μl1MMgCl2

1%NP-40150μlNP-40

DDH2O14.39ml

核提取缓冲液III（15ml）

25mMHEPES250μlHEPES

10%Sucro1gSucro

350mMNaCl700μl5MNaCl

0.01%NP401μlNP-40

DDH2O9.1ml

5MNaCl：14.61g/50mlH2O

注：

1在提取浆蛋白后，吸去上清时，如第一次用100μl枪洗不干净，再

离心，然后用10μl枪吸尽液体。再用III液洗一遍，如前步骤吸尽液

体，再加IV液，这样的去除浆蛋白污染效果较好些。

2胞浆蛋白混胞核蛋白原因：因为药物高浓度时，胞核会破裂，所以

会在高浓度处理组中胞浆蛋白混有胞核蛋白较严重；

3胞核蛋白对照组有时会提不到原因：可能是因为没有药物处理，所

精品资料

以其核不容易破开。如需要，可在步骤8去掉胞浆蛋白后用枪头打匀，

并振荡（我还没试过，这里只是建议）。

4我们浆蛋白内参用GAPDH或actin，没差别。核蛋白用HistoneH3。

精品资料

精品资料

WelcomeTo

Download!!!

欢迎您的下载，资料仅供参考！