糖蛋白

糖蛋白的结构、功能及分析方法

武金霞 赵晓瑜

(河北大学生命科学学院,保定071002)

摘 要: 综述了糖蛋白研究的重要意义、糖肽键的主要类型、糖链的主要类型、糖蛋白结构研究的一般策略

及结构分析的最新进展。

关键词: 糖蛋白 糖链 结构分析

StructureFunctionandAnalysisMethodsofGlycoprotein

WuJinxia ZhaoXiaoyu

(CollegeofLifeScienceHebeiUniversity,Baoding071002)

Abstract: Inthispaper,theimportanceofglycoproteinrearch,thetypesofglyco-peptidebonds,thetypesof

oligosaccharideschain,thegeneralmethodsofglycoproteinstructurerearch,andtheprogressofanalysismethodsin

thisfiledweresummarized.

Keywords: Glycoprotein Oligosaccharide Structureanalysis

1 糖蛋白的重要作用

糖蛋白(glycoprotein)是指由比较短,往往带分

支的寡糖与多肽链某些特殊部位的羟基或酰氨基共

价连接而成的一类结合蛋白质。细胞中的糖蛋白有

可溶性的,也有与膜结合的不溶形式,生物体内大多

数蛋白质是糖蛋白[1]。糖蛋白中蛋白质是生理功

能的主要承担者,糖链对蛋白质的功能起修饰作用,

即糖链影响蛋白质的整体构象,影响蛋白质的折叠、

溶解度、半衰期、抗原性及生物活性等,糖链与蛋白

质的相互作用介导细胞的专一性识别和调控各种生

命过程如:受精、发生、发育、分化、神经系统、免疫系

统恒态的维持等,在炎症及自身免疫疾病、老化、癌

细胞异常增殖及转移、病原体感染等过程中起重要

作用

[2,3] 。

糖链的合成并不是依据模板的复制过程,而是

包含了糖基的供体、糖基的受体、糖基转移酶及糖苷

酶等因素在内的复杂过程,除受酶基因表达的调控

外,还受酶活性的影响,即便在同种分子的同一糖基

化位点上,糖链的结构也有差异,即糖链有微不均一

性,这种不均一性反映了组织、细胞类型、发育和分

化阶段的不同,因此对糖链的结构及生物学作用只

能逐个的分别研究(cabyca)。糖链结构测定

和化学合成也远比核酸和蛋白质要困难,各国科学

家都在致力于糖链结构分析和合成方法学上的突

破,为糖链的功能分析提供技术支持。继功能基因

组学(functionalgenomics)和蛋白质组学(pro-

teomics)研究之后,糖组学(glycomics)正在成为全面

揭示生命本质所不可缺少的内容。

2 糖肽键类型

在糖蛋白的高级结构中,肽链折叠卷曲成特定

的空间结构,肽链上只有某些特殊的氨基酸序列位

点才能与糖链结合,糖链作为侧链和亲水基团暴露

在空间结构外面。

糖肽键是糖链和肽链的连接键,是指糖基异头

碳原子上的羟基与肽链氨基酸残基上的酰胺基或羟

基脱水形成的糖苷键。可分为N-糖苷键和O-糖苷

键两大类。参与糖肽键的氨基酸残基主要有:天冬

酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、羟赖氨酸

(Hyl)和羟脯氨酸(Hyp)。它们可以与N-乙酰葡萄

糖胺、N-乙酰半乳糖胺、木糖、半乳糖及阿拉伯糖形

基金项目:河北大学自然科学基金及河北省生物工程重点学科

作者简介:武金霞,女(1966-),河北大学副教授,主要从事生物化学及分子生物学方向研究

生物技术通报

·技术与方法· BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2004年第1期

成5种主要的糖肽键,分别是:β-N-乙酰葡萄糖胺-天

冬酰胺(GlcNAc-Asn)、α-N-乙酰半乳糖胺-丝氨酸/

苏氨酸(GalNAc-Ser/Thr)、β-木糖-丝氨酸(Xyl-Ser)、

β-半乳糖-羟赖氨酸(Gal-Hyl)、α-L-阿拉伯糖-羟脯氨

酸(Ara-Hyp)。此外,还发现罕见的以N-末端氨基

酸残基为连接点的糖肽键,存在于小鼠血红蛋白

A1c中。

2.1 N-糖苷键[4]

2.1.1 组成

N-糖苷键以β-N-乙酰萄葡糖胺-天冬酰胺为连

接点。在糖蛋白中仅有N-乙酰-β-D-葡萄糖胺残基

与天冬酰胺相连,生成的键是4-N-(2-乙酰氨基-2-脱

氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-L-天冬酰胺。

2.1.2 糖苷键附近的氨基酸顺序

N-糖苷键不仅与氨基酸种类有关,而且与氨基

酸顺序有关。带糖链的天冬酰胺残基附近往往含有

一个苏氨酸或丝氨酸残基,即它具有顺序子结构,称

为天冬酰胺顺序子:天冬酰胺-X-苏氨酸(Asn-X-

Thr)或天冬酰胺-X-丝氨酸(Asn-X-Ser),其中X可

代表除脯氨酸以外的任何一种氨基酸残基。表明糖

蛋白中能与天冬酰胺残基相连的寡糖链数目是有限

的,并非所有天冬酰胺顺序中的天冬酰胺都发生糖

基化,如鸡卵清蛋白。天冬酰胺顺序子不仅与糖基

化有关,可能对糖链的组成与长短也有控制作用,如

顺序子中的X为极性氨基酸时,常生成复杂型寡糖

链;X为非极性氨基酸时常形成单纯型寡糖链。

2.2 O-糖苷键[5]

主要有4种类型:

(1)以α-N-乙酰半乳糖胺-丝氨酸/苏氨酸残基

为起点,此糖肽键是3-O-(2-乙酰胺-2-脱氧-α-D-吡喃

半乳糖基)-L-丝氨酸或(苏氨酸)。是粘液糖蛋白的

特征键,在某些非粘液型糖蛋白中也有发现。

(2)以木糖-丝氨酸残基为连接点,大多数以木

糖残基与肽链上丝氨酸残基结合,形成O-糖苷键而

连接起来。

(3)以半乳糖-羟赖氨酸残基为连接点,此糖肽

键称为5-O-β-吡喃半乳糖基-5羟基-L-赖氨酸。是胶

原和一些胶原样多聚物的特征结构。在发生糖基化

的羟赖氨酸(Hyl)之后,紧接着往往是一个甘氨酸

(Gly)。

(4)以阿拉伯糖-羟脯氨酸残基为连接点,此糖

肽键称为4-O-β-D-吡喃阿拉伯糖基-4-羟-反式-L-脯

氨酸,目前仅在高等植物中发现,主要存在于绿色植

物和绿藻细胞壁的糖蛋白中。

3 糖链结构

糖蛋白的糖链可以是直链或支链,糖基数一般1

～15个左右。不同的糖蛋白分子中,其糖链数目不

等,多肽链上糖链的分布亦不均匀,如膜糖蛋白的糖

链全部分布在暴露于膜外侧的肽链上,而不存在于

膜的内部。理论上讲,糖蛋白上的糖链有无数种结

构模式,但生物体内可能有某种限制因素,使实际存

在的糖链类型大减。迄今发现,许多不同种类的糖

蛋白含有共同的核心结构。

3.1 N-连接的糖链[4]

N-糖链通常包含一个五糖核心结构,称为三甘

露五糖核心结构,该核心由内侧的两个GlcNAc和外

侧的三个甘露糖(Man)构成,其中两个α-Man,分别

以α1※3和α1※6与内侧的β-Man相连,各种生物

体内N-连接的糖蛋白糖链中均含有此结构。根据

五糖核心结构连接其它糖的情况,N-糖链分为以下

几类:

(1)高甘露糖型 寡糖链只含有甘露糖和N-乙

酰氨基葡萄糖,而且只有甘露糖连接在五糖核心区

上,如卵白蛋白。

(2)复杂型 寡糖链除含有甘露糖和N-乙酰氨

基葡萄糖外,在甘露糖上还连接有半乳糖、岩藻糖和

唾液酸等。α1※3Man的C

2

和C

4

位,以及α1※6Man

的C

2

和C

6

位上连接外侧糖连,即天线,可分为二天

线型(C2C2)、三天线型(C2,4C6)和四天线型

(C

2

,

4

C

2

,

6

)。只有极少数是单天线型的,五天线型仅

发现于鸟类卵清中。

(3)杂合型 又称混合型,既有高甘露糖链,又

有N-乙酰氨基半乳糖链,连接于五糖核心的两个α-

Man上,如卵清蛋白。

(4)核心岩藻糖型 五糖核心的最内侧GlcNAc

上以α1※6连接岩藻糖(Fuc)。

(5)平分型β-Man上连接一个GlcNAc。

3.2 O-连接的糖链[4]

O-连接的糖链存在多种形式,如GalNAc-Ser/

Thr,GlcNAc-Ser/Thr,Gal-Ser,Ara-Ser/Thr,Man-

32

生物技术通报Biotechnology Bulletin 2004年第1期

Ser/Thr等。这类糖类结构共同点,是由一种或少数

几种单糖与某些含羟基氨基酸连接,不存在共有的

核心结构,但在O-GalNAc连接的糖链中已发现有4

类核心结构。其中研究得最多的是粘蛋白、血浆蛋

白和膜蛋白。

4 糖链分析策略

4.1 糖蛋白及糖链结构的定性鉴定

样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳后用Shiff试剂、甲

苯胺蓝、硫酸-百里苯酚等染色可以定性鉴定糖蛋

白[6～8],也可以电泳后进行Western印迹,将蛋白条

带转移至硝酸纤维素膜上,再以糖蛋白测定试剂盒,

进行糖蛋白定性试验[9]。

凝集素是一类能识别、结合特异单糖或糖链结

构的糖蛋白,糖结合专一性不同的凝集素,可以区别

糖残基的连接方式、分支和修饰情况,因此凝集素不

仅能用于寡糖和糖复合物的分离纯化,还能用于糖

链结构分析。常用凝集素亲和层析、亲和沉淀、亲和

电泳、酶联免疫(ELISA)、印迹等方法鉴定分离糖

链、糖肽及鉴定糖链结构[10]。

4.2 糖蛋白及糖肽的制备

糖蛋白的分离制备常采用离子交换层析、凝胶

过滤、凝集素亲和层析等方法;糖肽的制备首先要用

蛋白酶切断蛋白主链,糖蛋白的酶解,酶的用量比纯

蛋白的酶解要多几倍,时间也更长。糖肽片段的分

离一般采用各种层析方法。

4.3 从糖肽片段上切下糖链

4.3.1 酶法[11]

常用的酶有glycopeptidaA、N-peptideglycosi-

daF、内切β-N-乙酰半乳糖胺酶、内切β-N-乙酰葡

萄糖胺酶、内切α-N-乙酰半乳糖胺酶、内切β-半乳糖

苷酶。酶切法具有高效、专一、条件温和等特点,但

酶价格昂贵,如果所用的酶是糖蛋白,那么酶本身造

成的糖链污染也是必须考虑的问题。

4.3.2 化学法[5]

β-消除反应广泛应用于含N-乙酰半乳糖-丝氨

酸/苏氨酸(Gal-NAcSer/Thr)连接的糖蛋白或糖肽;

肼解法用于含N-乙酰氨基葡萄糖(Glc-NAcAsn)连

接的糖蛋白或糖肽。为了避免肼对糖链的水解及脱

乙酰作用,肼解后需对糖链进行还原及乙酰化;三氟

乙酸酸解法主要用于Glc-NAcAsn连接的糖肽或糖

蛋白。较温和的三氟乙酸水解条件可避免还原端与

次末端的己糖胺残基受到破坏。

4.4 寡糖链的分离纯化

常采用纸层析、薄板层析、SephadexG-25、

SephadexG-50层析分离蛋白与寡糖链,但葡聚糖凝

胶上脱落的可溶性葡聚糖片段会造成污染,因此用

聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel分离。所有未知糖链的纯

化,均需要HPLC来完成,固定化凝集素可以用来纯

化具有特异结构的寡糖。

4.5 糖链的结构分析

要阐明一种寡糖链结构,必须了解以下内容:分

子量、单糖残基组成、单糖残基间的顺序、环状结构

的类型、糖苷键的构型、α-,β-异头异构体、羟基被取

代情况等。

糖的组分复杂,结构相似,没有显色基团,如果

不经衍生难以进行光谱、色谱分析,因此糖链结构分

析难度较大。传统的方法有凝胶过滤法、蒸气压法

(测定分子量);部分酸水解、完全酸水解、纸色谱、气

相色谱法(测定单糖残基组成);选择性酸水解、糖苷

酶顺序水解、凝集素亲和层析(单糖残基间的顺序);

红外光谱(环状结构的类型);单糖与氨基酸组成分

析、稀碱水解、肼解反应(糖苷键的构型);糖苷酶水

解、核磁共振、红外光谱(α-,β-异头异构体);甲基化

反应-气相色谱、过碘酸氧化(羟基被取代情况)。

前几十年质谱就应用于糖类化合物的分

析[12,13],应用GC-MS可了解单糖组成及大致的分

枝情况[14]。快原子轰击电离质谱(FAB-MS)和液态

二次离子质谱(LSI-MS)[15,16]可以测定nmol样品/

μl基质的寡糖,并可获到分子量信息和结构信息。

将分离技术与质谱法相结合是分离科学方法中的一

项突破性进展,LC-MS可以同时检测糖肽的位置并

且提供结构信息。毛细管电泳(CE)与质谱的联用技

术[17],在一次分析中可同时得到迁移时间、分子量

和碎片信息,是LC-MS的补充。大气压电喷雾

(ESI)质谱系统的建立,即使只有pmol量级且未经

衍生的大分子寡糖样品,也可以使用ESI分

析[18,19]。基体辅助激光解吸-电离质谱(MALDI-

MS)[20～22]

可以精确地测定ng量级的葡聚糖(糊

精),相对分子质量达7000u.,能快速(数分钟1个

样品)、准确(可达几千分之几)、高灵敏度(nmol量

332004年第1期 武金霞等:糖蛋白的结构、功能及分析方法

级)测定大分子多糖相对分子质量,该技术的灵敏度

由于引进Q-TOF(QuadTimeFlight)而大幅度提高,

可分析飞摩尔(10～15mole)级的样品以提供糖蛋白

糖基化位点和糖链序列信息,这些技术与外切糖苷

酶、荧光标记衍生物、HPLC/CE和NMR技术的联

合使用,可测定出糖链的组成和连接方式。

5 糖链在糖蛋白中的作用

获得糖链的精确结构信息是研究糖基化对蛋白

质功能影响的基础。克隆蛋白质基因,采用定点突

变技术使蛋白质的糖基化位点发生改变,再将突变

基因转化具有糖基化修饰的受体菌,或者将完整的

蛋白质基因转化糖基化修饰缺陷型的受体菌,比较

分析表达产物与天然产物的生化性质和生物学活性

的变化;选择不同酶切位点的糖苷酶水解糖链,也可

以分析失去糖链的蛋白部分的性质变化。

6 糖生物学研究的限制因素及趋势

目前糖生物学研究中要解决的关键技术问题是

糖链结构分析和合成方法的建立。在糖链的分析上

需要建立高分辨率、快速的序列测定方法和构象研

究的方法、模型;在合成上需要建立高效的合成方

法。但糖链的结构分析和合成很难象核酸和蛋白质

那样完全靠化学方法解决,因此化学法和酶法相结

合是发展趋势。在功能研究方面,主要是研究糖链

合成代谢途径和糖链在细胞内、细胞间的功能,其前

沿领域为糖基化、细胞粘附分子(即识别糖链信息分

子的蛋白质)与糖链的相互作用及糖在微生物感染

中的作用3个领域。

参考文献

1 iology,1993,3(20):97～130.

2 PerezS,MouhousR,NifantE,iology,1996,6:537～

542.

3 WangX,SunP,AlqamariA,em,2001,276:8436～

8444.

4 吴东儒,糖类的生物化学.北京:高教出版社,1987,747.

5 张维杰,复合多糖生化研究技术.上海:上海科技出版社,1987,

160.

6 HartmutG,em,1971,246(20):6339～6340.

7 DevenyiT,GergelyJ.实用蛋白质化学技术.上海:上海科技出版

社,1982,52.

8 ochem,1979,99:474～476.

9 孙秀琴,中村健,伊滕洋一,石原和彦,等.中国寄生虫病防治杂

志,2001,14(4):285～287.

10 孙建中,王克夷.生物化学与生物物理进展,1994,21(2):104～

109.

11 FukudaM,l,1989,197(19):

12 MechrefY,v,2002,102:321～37.

13 DellA,e,2001,291:2351～2356.

14 ydrRes,1985,140～141.

15 ,1981,293:270.

16 AberthW,StrubKM,BburlingameAL,em,

1982,54:20～29.

17 OlivaresJA,NhungT,Nguyen,em,1987,59:12

～30.

18 DuffinKL,WelplyJK,HuangE,em,1993,65:

2791.

19 LiT,OhashiY,MatsuzakiY,ectrom,1993,28:

211.

20 MechrefY,em,1998,70:455～463.

21 ColangeloJ,em,1999,71:1479～1482.

22 GeyerH,SchmittS,WuhrerM,em,1999,71:

476～482.

(上接第38页)

8 StillIH,VinceP,cs,1999,58(2):165～

170.

9 HerC,Doggett,cs,1998,52(1):50～61.

10 刘春宇,张春玲,夏家辉.生物化学与生物物理进展,1998,25

(5):434～439.

11 彭永德,宋怀东,等.上海第二医科大学学报,2001(4):292～

295.

12 ModrekB,ReschA,GrassoC,cAcidsRes,2001,

29(13):2850～2859.

13 Picoult-NewbergL,Res,1999,9:167～174.

14 H,1996,14(8):261～272.

15 VelculescuVE,e,1995,270:484～487.

16 HwangDM,DempyAA,WangRX,ation,1997,

96(12):4146～4203.

17 LanfranchiG,MuraroT,CaldaraF,Res,1996,6

(1):35～42.

18 MaoM,FuG,WuJS,tlAcadSciUSA,1998,95

(14):8175～8180.

19 胡仁明,彭永德,等.中华内分泌代谢杂志,2000,16(1):10

～14.

20 宋怀东,胡仁明,等.中华内分泌代谢杂志,2000,16(5):292

～296.

21 GreenP,LipmanD,HittierL,e,1996,259

(5102):1711～1716.

22 e,1996,286:453～456.

34

生物技术通报Biotechnology Bulletin 2004年第1期