研究进展

1

中药研究进展综述

高乃群S080601018分析化学专业

中药要走向世界，服务于全人类，就必须规范化、标准化、

工程化、现代化。中成药多以复方为主，原料多是生药，生药又

因各地用药习惯不同、产地和采收季节不同等因素影响，有效成

分含量波动较大，导致产品质量不稳定。因此对产品中有效成分

的定性、定量检验和控制是稳定药效的重要方面。

如果将处方中各味中药的作用找到对应的有效成分，即可根

据该成分的化学结构设计提取工艺，用HPLC检测各有效成分的

含量，最后用提取物组方。这样，成分是已知的，数量是确定的，

质量就得以稳定。在这里，处方是一个群(Group)，处方中的任

意一味中药是构成该群的一个集合(Set)，该集合又由成分子集的

并(Union)组成。一个子集是一个点阵，经过不同的提取分离工艺

处理，点阵转化成三维立体矩阵。点阵中的一个元素(Element)

代表子集中的一个成分，一个成分有一种化学结构，一种结构就

具备一种药理活性，药理就是结构到药效的映射(Map-ping)，药

效是结构的象(Image)。随着提取分离工艺的不同，点阵中各元素

转变成三维立体矩阵后对应的各元素的高度不同，也就是各成分

的含量不同。一种结构成分的量决定着它的活性功能的强度，譬

如ED

50,本集合有单元素集，但没有空集。本集合都是有限集。

当本集合是单元素集时，处方中只有一种成分，即为作用单一的

西药。成分在人体内的作用是其结构和数量的函数，而成分的数

2

量又是提取工艺的函数。

中药复方的组合配伍是有机的、相互紧密联系的，是一个整

体结构，每味中药间的相互作用是建立在成分结构、数量基础上

的。同一味中药在不同处方中有不同的作用，作用的强度用剂量

来控制。所以对每一个处方都要认真研究，搞清处方中每味中药

的作用和引起此作用的有效成分，根据这些成分的化学结构才能

设计提取工艺，提取的目的是拿到能够实现该药理功能的有效成

分，而非本中药的主要成分。不同的提取工艺会得到不同的成分

矩阵，且矩阵中的元素相互间是有交叉作用的，所以工艺定向错

误将导致新组成的复方功能偏离主治目标，甚至毒副作用增加，

没有医疗效果。

提取物组方不是机械的混合，一定要保证原处方结构的整体

性、完整性和有机性。通过定向提取的成分集合，可以用HPLC

测得有效成分的含量，根据含量和工艺收得率及原处方的生药用

量，计算出该提取物的配伍剂量。这种由提取物组成的复方，因

其成分和工艺确定，把原料的品种、药用部位、产地、采收季节

等因素均以产品收得率的形式消化在生产成本中，即产地、季节

等差异只引起收得率的差异、成本的差异、价格的差异，而不引

起质量的差异，从而使复方的成分得以量化，质量得以稳定。确

保了医生开什么药，患者用什么药;医生开多少，患者用多少;医

生怎么开，患者怎么用。确保了医和药的统一，处方和药品的统

一，药性和疗效的统一，医生和患者的统一。

3

有什么结构就有什么功能，用什么工艺就得到什么结构;结

果跟着方法走，药理跟着成分走，成分跟着工艺走;药效是成分

的函数，成分是工艺的函数。

下面介绍一些中药的分离方法,以供借鉴:

银杏叶中提取黄酮的最佳工艺条件研究

银杏叶LeavesofGinkgobilobaL.提取物GBE主要含黄酮、内酯

两大部分活性成分。总黄酮以山奈酚Kaempferol、槲皮素、异鼠李

素Lsorhamntin的甙为主;萜内酯则以银杏内酯GinkgolideA.B.C和

白果内酯BilodalideA为主。GBE可扩张冠脉血管,增加脑血流量,

拮抗PAF,可治疗由于血管老化、脑血管供血不足所致的多种疾病。其

提取方法有些报道,但缺乏系统性的研究本研究对其生产工艺条件

做了较深入探索,在最佳条件下,GBE中黄酮含量稳定在26%以上,

内酯含量稳定在6%以上。

1.实验

111设备、仪器和材料

3m3不锈钢提取罐,JN—500型不锈钢真空浓缩罐,015m3不锈钢

沉降槽,TMS—3型板框压滤机,1m3不锈钢吸附床,NZ—80型真

空浓缩罐.

Waters600—E型高压液相色谱仪。

乙醇,食品一级;烧碱,工业一级;AB28型树脂,南开大学化工厂产;

4

银杏叶.

三氯甲烷、醋酸乙酯、甲醇、甲苯、丙酮、三氯化铝等,均为分析纯.

11.2提取工艺流程和实验操作步骤

提取工艺流程见图

银杏树叶阴干粉碎,置于提取罐中,用90%乙醇80℃回流提取3

次,每次115h,提取液合并后加入JN—500真空浓缩罐中在60℃

下减压浓缩成浸膏。将此浸膏置于沉降槽中加水搅拌溶解,静置沉降

3h,然后由上而下抽取上板框压滤机过滤,得到的滤饼重复水沉降操

作。水沉降加水量为前两次是银杏浸膏体积的3倍和2倍,第三次

以后均为1倍.

合并所有的水沉降过滤液,用盐酸调整pH值,按树脂重量

的两倍计量取液,上树脂床进行吸附,待液流完后,分别用水和25%

乙醇洗涤床层,然后用70%乙醇进行洗脱,洗脱终点为用薄层色谱

法检查无黄酮。用NZ—80真空浓缩罐将洗脱液在60℃下减压浓

5

缩回收乙醇后,进行干燥成粉。

最后一次过滤得的滤饼用少量甲醇拌成稠浸膏,加醋酸乙酯进行

溶解沉降3次,每次都需过滤除杂,滤得的醋酸乙酯溶液经适度浓

缩后,进行柱层析,采用薄层色谱法检查出含银杏内酯和白果内酯的

流液段,再浓缩结晶出总内酯,将此结晶与前面干燥得的粉末混匀,

即得到GBE成品。

113分析方法

提取过程控制分析采用薄层色谱法,条件如下:

黄酮:硅胶G+0.5%CMC,110℃活化90min,CHCl/MeOH/EOE

2∶1∶1展开,喷5%三氯化铝的乙醇液,热风吹干后365nm荧光

灯下检查。

内酯:硅胶G+0.5CMC,110℃活化90min,To1./MeCO7∶3展开,

吹干后,先喷水看准白色斑点位置,再用强热风吹干30s,于荧光灯的

365nm和254nm波长下观察内酯斑点.

3结论

银杏黄酮提取过程的最佳工艺条件为:对90%乙醇回流提取得

到的浸膏,采用5次水沉降除杂;在pH3～4条件下进行吸附操作;用

树脂重量的13倍水和7倍25%乙醇先后洗涤已吸附黄酮的树脂床;

树脂每吸附过3次再生一次;洗脱液浓缩后采用喷雾干燥法干燥,条

件为进口180℃,出口80℃。在此最佳工艺条件下产品质量稳定,

符合德国标准,收率在112%～116%之间以银杏)叶干重计。

紫杉醇的研究进展

6

紫杉醇（taxol，商品名Paclitaxel）是wall及其合作者首次从短

叶红豆杉Taxusbrevifolia树皮中分离得到的一种重要的次级代谢产

物.自1956年发现至今已有近50年的历史。美国FDA于1992年批

准紫杉醇注射液上市,它对卵巢癌、乳腺癌等均有显著疗效，对黑色

素瘤、结肠癌和人免疫缺陷病毒（HIV）引起的卡波济肉瘤亦有较好

的疗效。紫杉

醇目前主要从红豆杉的树皮中提取，难以满足市场需要。由于

紫杉醇在植物体内的含量相当低（目前公认含量最高的短叶红豆杉树

皮中也仅含0.069%)，加上资源很匮乏，而且红豆杉属植物生长缓慢，

对紫杉醇的进一步开发利用造成了很大的困难。因此，找到合适的紫

杉醇生产来源非常重要。下面介绍一些分离方法,进行比较;

一.传统的工业分离方法

1.仪器设备和材料

1m3不锈钢渗漉罐,1m3不锈钢回流提取罐、3m3不锈钢萃取罐(自

制),NZ80不锈钢真空浓缩罐(常熟中药制药机械总厂),T-M-S-3型板

框过滤机(浙江海宁过滤器材厂),Φ200×2000mm不锈钢色谱柱

(自制),Φ50×1500mm、Φ30×1200mm玻璃色谱柱(自制)。

红豆杉茎皮,采于四川贡嘎山.其紫杉醇含量约67ppm。

2.方法和结果

2.1提取

提取中国红豆杉茎皮经粉碎,自然阴干,得干燥度为80%的棕黄色

丝状粉末.取原料粗粉100kg于回流提取罐中,加95%乙醇回流提取3

7

次,每次1.5h。提取液于60°C减压浓缩成浸膏,加水沉降3次,板框

压滤机滤取清液,以二氯甲烷萃取6次。萃取液加无水硫酸钠干燥脱

水,于40°C浓缩成膏,真空抽干。还可以用1%醋酸渗漉提取:方法如

下:

取原料粗粉100kg于渗漉筒中,加1%醋酸水溶液浸泡24h后开

始渗漉,流速500ml/min。收取渗漉液8倍量(按原料重量计),以二氯甲

烷萃取6次。萃取液加无水硫酸钠干燥脱水,于40°C浓缩成膏,真空

抽干。

2.2分离

取柠檬酸渗漉提取的总萜以氯仿溶解,拌入等重量的80~100目硅

胶,于室温干燥后进行柱色谱分离。将100~160目硅胶20kg装入Φ

200×2000mm不锈钢色谱柱敲实,以氯仿-甲醇(99∶1)湿润,按硅胶:

总萜=8∶1加入拌过硅胶的总萜样品5kg(含总萜2.5kg),然后用氯仿-

甲醇(99∶1)洗脱,每流份2000ml,流速为每流份40min。每流份抽样

200ml浓缩后以TLC检查成分分布情况。TLC条件:硅胶H以1%CMC

铺板,于105°C活化90min,板厚0.1mm;以氯仿-甲醇(97∶3)展开;喷

5%硫酸吹热风显色。合并含1流份,减压浓缩抽干,得含1部位430g。

合并6根色谱柱的这一部位共约2500g,以氯仿溶解拌入等重量

80~100目硅胶,于室温干燥,再进行柱色谱分离。取100~160目硅胶20

kg装入Φ200×2000mm不锈钢色谱柱敲实,先以氯仿-醋酸乙酯

(4∶1)湿润,然后将上述样品上样。以氯仿-醋酸乙酯(4∶1)洗脱,每流

份2000ml,流速为每流份40min。每流份抽样200ml浓缩后以TLC

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检查成分分布情况。TLC制板条件同上;氯仿-甲醇(96∶4)展开;喷5%

硫酸吹热风显色。合并各相应流份,减压浓缩抽干得到:t前交叉部位

124.3g(TLCRf值大于t的杂质和t的混合物),t后交叉部位82.7g

(TLCRf值小于t的杂质和t的混合物),c、t交叉部位570.2g(含

c48%,t52%)。

2.3紫杉醇(t)和三尖杉宁碱(c)的分离

c和t的常规分离一般采用分配柱色谱分离,时间长,消耗大,分离

效率很低,是1提取工作中的一道难关。其后采用制备高效液相色谱

方法分离,虽然分离效率有所提高,但仍难以形成规模化生产。

c的侧链结构中,由于C′5----N′4酰胺的影响,C′7----C′6的

双键π电子云向C′6乃至C′5方向偏移而有利于溴的进攻;而t的

侧链的这一位置系一苯环,相对于c其电子云密度比较均匀而稳定。

在温和条件下,c易于发生溴加成,而t却无此条件。利用c、t结构中

的这一差异,采用溴加成方法改变c的侧链结构,从而改变其分子的极

性,可大大降低柱色谱分离c、t的难度,采用普通的硅胶吸附柱色谱即

可取得满意的分离效果。

为了使副产物减到最小限度,加成反应的原料应只含有c、t两成

分,所用溶剂也以极性越小越好。红豆杉总萜经过前述两次硅胶柱色

谱分离,可以得到TLC只呈一个斑点的c、t交叉部位,能够满足溴加成

反应对原料的纯度要求。其具体操作如下:

A——取上述c、t交叉部位17g,加入四氯化碳80ml使溶解,加

水1滴。

9

B——取溴0.5ml加入四氯化碳10ml使溶解。将B缓缓加入A

中,边加边搅拌,于室温反应5min,然后进行柱色谱分离。取100~160

目硅胶340g装柱,以四氯化碳湿润,将溴加成反应液加入柱顶,以四氯

化碳冲洗至冲洗液基本无色,然后用氯仿-甲醇(100:1)洗脱,收集含t流

份,回收溶剂得1粗品7.2g。用乙醇溶解,加入5倍量蒸馏水,析出紫杉

醇,抽滤,水洗,减压烘干得精品5.03g。HPLC测定含量为99.19%。

HPLC条件:

ZorbaxODS柱(4×250mm),流动相乙腈-水(45∶55),流速1.5

ml/min,检测波长227nm,测定结果见图

柱色谱分离的非紫杉醇部分溶于乙醇,用5%氢氧化钠溶液调节

pH至9.5~10,于室温水解1h后,以硅胶柱色谱分离,以氯仿-乙醚(8∶

2)洗脱,得到baccatin-Ⅲ。

红豆杉茎皮粗粉4160kg(含紫杉醇67ppm),采用上述1%柠檬酸渗

漉,柱色谱分离及溴加成后柱色谱分离工艺,共得到紫杉醇精品187.6g,

收率为45ppm,紫杉醇的回收率可以达到70%左右。

参考文献

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10

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2WitherupKM,LookSA,od.

3章菽等.药学学报,1992;27(4)∶268

4紫杉醇生产新工艺研究陈冲罗思齐

二.超临界二氧化碳流体萃取红豆杉枝叶中

紫杉醇的研究

1材料

CO

2

-SFE装置(南通市成宇石油科技开发有限公司)萃取器容

积为1000ml操作压力可达50MPa,第一和第二分离器均为500

ml操作压力可达10MPa,萃取器和第一分离器均有保温装置,操

作温度可达90℃。HPLC:为日本岛津LC-6A型高效液相色谱仪;

红豆杉枝叶:由信丰金盆山林场红豆杉种植基地提供;紫杉醇对照

品:由华西药学院研究所提供;CO

2

气体:食品级,纯度为99.5%;其

余试剂为分析纯。

2方法

提取液均用HPLC测定紫杉醇含量。

2.1CO2-SFE法萃取紫杉醇取300.1687g粒径为0.25~0.

45mm的枝叶样品在27.6MPa,31℃进行超临界CO2流体萃取,

因为超临界CO2流体对极性强的物质溶解能力较差,加入少量的

甲醇作为夹带剂,可大大增加其溶解能力。将样品放入萃取池

中,CO

2

和甲醇分别由CO

2

泵和夹带剂泵打入各泵的腔体中,经流

体混合后,流入萃取器中的集流腔,达到27.6MPa,31℃后进入萃取

11

池开始萃取,动态萃取时,超临界流体经限流器流入收集瓶后减压

排放,流体带出的物质溶于收集液中予以收集,用甲醇作吸收液,

在30,60,90,120min各收集1次,收集液经旋转蒸发浓缩,并于50℃

真空干燥2h后检测其中的紫杉醇含量。

2.2紫杉醇含量测定

2.2.1色谱条件色谱柱:贝克曼ODS(10μm,4.6mm×

250mm);流动相:乙腈-甲醇(30∶70);检测波长:227nm;流速:1.

0ml/min。

2.2.2线性关系精密称取紫杉醇约25mg,加醇至250m,l

分别量取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0m;l分别加入流动相,定量至

25m,l取10μl进样,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,得回归方

程为Y=-973.6+287.1X,r=0.999,表明紫杉醇在10~25μg/m,l浓

度内峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.2.3回收率实验准确称取紫杉醇对照品10mg,于100ml

容量瓶中加入溶剂,定量过滤,滤液摇匀,得到对照储备溶液。精密

量取3ml置于25ml容量瓶中,加入流动相稀释至刻度定容,进样

10μl。计算平均回收收率为99.98%,RSD=0.97%(n=6)。

2.2.4稳定性实验将上步溶液陈化6h,重复进行,峰面积基

本不变,避光放置24h,峰面积基本不变。

2.2.5含量测定分别精密称取紫杉醇对照品自制试样,10

mg加入流动相溶解并制成2μg/m,l按上述方法测得谱图,由归一

化方程计算出含量为64.48%。

12

2.2.6杂质的处理实验对比参照样制备:准确称取紫杉醇

对照品10mg。已知杂质对照品10mg,置于50ml容量瓶中,加流

动相稀释至刻度,摇匀,精密量取5ml置100ml容量瓶中,加流动

相并稀释至刻度。自制样品制备:准确称取自制样5mg置于250ml

容量瓶中,加流动相稀释至刻度。取对照样品和自制样品各10μl

进样,记录色谱图对自制样品出现的已知杂质,按外标法计算含量,

对于自制样品出现的未知杂质,则与对照品溶液中紫杉醇峰比较

计算,最后计算出杂质含量。

3结果

利用超临界CO2流体萃取法从红豆杉枝叶中提取分离紫杉

醇,用高效液相色谱法测定萃取物中紫杉醇含量,其结果表明,粒

径为0.25~0.45mm的红豆杉枝叶在27.6MPa,31℃下以甲醇为

夹带剂和吸收液进行萃取,在2h内可使紫杉醇萃取完全,萃取率

达96.5%,萃取物中紫杉醇纯度可达1%,以贝克曼ODS4.6mm×

250mm为色谱柱,乙腈—甲醇为流动物,流速1.0ml/min,紫杉醇

在10~25μg/ml范围内线形良好,平均回收率为99.98%,RSD=0.

97%。平均回收率为99.98%,RSD=0.97%。

紫杉醇粒径为0.25~0.45mm时,流动相选择乙腈-甲醇

(30∶70)分离效果最好,峰形对称;波长在225nm~229nm处均可

得到有效波形,本实验选择实际测量结果的平均值,即227nm,此波

长下检测效果最为明显。由于紫杉醇本身具有邻位两个环内双键,

具有一定的化学活性,因此检测样不能长期保存,避免与氧化剂接

13

触。

参考资料

史清文,赵丁,刘素云,等.天然药物紫杉醇的研究概

况与开发综述[J].天然产物研究与开发,1997,9(3):102.

三.内共生真菌生产紫杉醇

1.生产简介

共生关系是指一个以上的有机体，双方建立互利共存、或一

方有利而对另一方无害地生活在一起的一种关系.

共生是生物适应自然环境的一种必然现象，不同种类的生物

常以种群方式聚集在一起生活，不同种类的生物之间以及微生

物与其它生物之间也存在十分复杂的相互关系，通过它们的相

互作用促进了整个生物界的进化和发展。

内共生真菌(又称内生真菌，endophyticfungus，endofungus，

endophyte)是存在于健康植物的组织和器官内部中，形成不明显

浸染的各种真菌，是植物微生态系统的天然组成部分。1993年

美国学者Stierle等首次从短叶紫杉(Taxusbrevifolia)的韧皮部中

分离出一种新的内共生真菌Taxomycesandreanae，可在半合成

培养液中产生紫杉醇和紫杉烷类化合物，表明有的内共生真菌

具有合成和宿主植物相同或相似的活性成分的能力。这一发现

为用微生物发酵法生产紫杉醇以解决紫杉醇药源危机提供了一

条新途径,并成为从药用植物中分离内共生真菌热潮的开端，为

人类解决某些药用植物生长缓慢、资源紧缺等因素带来的药源

14

紧张和生态破坏问题，利用植物内共生真菌进行工业化发酵生

产某些重要天然药物提供了新的思路。

2.检测

HPLC在分离紫杉烷类化合物方面更具优势，尤其

是定量分析，因而得到广泛研究。紫杉醇的HPLC分析

始于80年代末，随后得到了广泛应用。正相、反相色

谱均有应用，分离用到的固定相也有10多种。由于紫

杉醇和与其伴生的紫杉烷类化合物在化学结构和极性

方面极为相似，因而分离纯化具有很高的难度。广泛应

用的普通填料主要有ODS(C18)、氰基柱和苯基柱。用

这些填料的HPLC柱，虽然可以实现紫杉醇和三尖杉宁

碱的分离，但却不能有效地分析出另一个非常难以分离

的7-表-10-去乙酰紫杉醇(7-epi-10-deacetyl-taxol)。为

解决这一难题，已开发出包括diphenyl、

pentafluorophenyl(PFP)在内的10多种新型填料。这些专

门用于紫杉烷类化合物分离分析的HPLC柱，在测定紫

杉醇含量时，排除了杂质干扰，使测定结果更准确可信，

具有很好的分离效果。此外，具有极高柱效的微型柱

(microcolumn)也有应用.

在HPLC分析方法方面，除了开发新型填料外，通

过改变流动相的组成，或选择适当的洗脱方式，也能有

效地解决上述问题。在分离过程中，采用的流动相通常

15

为乙腈-水或甲醇-水二元溶剂系统。在流动相中加入磷

酸盐缓冲溶液，或醋酸铵缓冲溶液，或采用乙腈-甲醇-

水三元溶剂系统，均可以改善分离。此外，梯度洗脱方

式也得到广泛采用，收到良好效果。HPLC法分析紫杉

醇，绝大多数使用的是紫外检测器，检测波长多为

225nm～230nm，检测限为μg/mL级。

HPLC/MS质谱能从复杂的混合物中准确找到与要

求相符合的一定分子量(m/z)的物质，而不需要较高的纯

度，是检测混合物中特定成份的有效方法，结合HPLC

的高效分离，更能对混合物中的微量成份作出定性、定

量分析。Auriola和Bitsch等分别成功地实现了

HPLC/MS联用技术，来分析检测紫杉烷类化合物，检

测限可提高到ng/mL级。

毛细管电泳法

毛细管电泳(CapillaryElectrophoresis,CE)作为迄今

分辨率最高的分离技术，应用日趋广泛。Chan等首次

将高效毛细管电泳(HPCE)引入紫杉醇的分析，采用的是

胶束电动色谱(MEKC)分离模式。Hempel等则成功地将

MEKC用于生物体液中紫杉醇的定量分析，检测中使用

紫外检测器(228nm)，检测限可达20ng/mL，线性范围

为50ng/mL～5000ng/mL，显示了良好的应用前景。

参考文献

16

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5.赵凯,周东坡,王伟.培养基组成对树状多节孢紫杉醇产

量的影响.菌物研究(JournalofFungal

Rearch),2003,1(1)24?27.

致谢:

感谢医药学院<<药学研究进展>>的任课老

师们,通过本门课的学习,我对医药有了更深刻

的认识和全面的了解,将使我在以后的医药研

究中获益.