叶绿素含量测定

测叶绿素的方法

叶绿素含量的测定方法主要有紫外分光光度法、荧光分析法、活体叶绿素仪法、光声光谱法和高效液相色谱法。不过目前应用最为广泛的还是分光光度法。
叶绿素提取液的吸收光谱表明：有两个强吸收峰，分别在红光区和蓝紫区，不同提取溶剂和原料所得的叶绿素溶液的吸收光谱比较相似。叶绿素a、叶绿素b的红区最大吸收峰分别在663nm、645nm附近，在蓝紫区分别为429nm、453nm附近。由于提取溶剂和原料不同，对叶绿素提取液进行光谱扫描后，所得的最大吸收值可能有较小范围的浮动。
高效液相色谱(HPLC)定量检测叶绿素含量准确率较高，效果很好。用甲醇和丙酮作为流动相，体积比为80：20时，同时在流动相中加入质量分数为0.1%的冰醋酸，流速为1.0mL/min。利用每一种色素的色谱峰面积进行定量，叶绿素a、叶绿素b的定量可通过外标法由工作曲线求得。[8]
稳定性影响因子
光
在活体植物中，叶绿素得到了很好的保护，既可以发挥光合作用，又不会发生降解。但离体叶绿素对光照很敏感，光和氧气作用可导致叶绿素不可逆的分解。在自然条件或以胶态分子团存在的水溶液中，叶绿素在有氧的条件下，可进行光氧化而产生自由基，因此一些研究人员认为叶绿素的光氧化降解必需有氧分子参与，而且其降解速率随氧分子浓度的升高而加快。单线态氧和羟基自由基是叶绿素光化学反应的活性中间体，可与叶绿素吡咯链作用而进一步产生过氧自由基和其他自由基，最终可导致卟啉环和吡咯链的分解既而造成颜色的褪去。当然影响光氧化的因素有很多，比如体系中的水分、温度、光照时间、光照强度、光的波长范围等等，在这些影响因素中主要有光照时间、光照强度、光的波长范围、氧的浓度。目前在此方面的研究主要集中在自然光(复合光)对色素的影响而且大多数研究不是很深人。对于单色光(不同波段的光)对叶绿素稳定性的影响研究方面的报道却较少。
叶绿素酶
已有研究表明，叶绿素酶是一种糖蛋白。叶绿素酶催化叶绿素结构中的植醇键而水解生成脱植叶绿素，是叶绿素降解中的关键酶。叶绿素酶是以叶绿素作为底物的，它是一种酯酶。脱镁叶绿素也是叶绿素酶的底物，酶促反应的产物是脱镁脱植叶绿素。叶绿素酶的最适反应温度在60～80℃范围，实验证明，叶绿素酶在80℃以上其活性下降，100%时已完全失活。
温度
一些研究表明，叶绿素提取液在不同受热温度下，其降解速率曲线有明显的拐点，叶绿素在80℃以下，降解速度较慢，90℃以上降解速度急剧加快。总体而言，随着温度的升高，叶绿素降解的速率是逐渐加快的，只是较低的温度下降解速率不明显。
pH值

叶绿素含量测定

常用叶绿素提取试剂： 丙酮 、乙醇、 N，N-二甲基甲酰胺(DMF)
提取方法：研磨、浸泡
丙酮法测定叶绿素含量
乙醇:丙酮:H2O = 4.5:4.5:1 (体积比)
提取方法对比：
常规方法是研磨提取
改进方法是浸泡提取
提取注意事项：

叶绿素a = (12.72A663-2.59A645) × v/w × 1,000
叶绿素b = (22.88A645-4.67A663) × v/w × 1,000
叶绿素总含量 = (20.29A645+8.05A663) × v/w × 1,000

叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定，叶绿素的含量与植物光合作用及氮素营养有密切的关系,在科学施肥、育种 及植物病理研究上常有测定的需要。

一、目的 掌握叶绿素a、b 含量测定的基本原理和方法。 叶绿素含量的测定叶绿素的含量与植物光合作用及氮素营养有密切的关系,在科学施肥、育种 及植物病理研究上常有测定的需要。

二、叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，是一类含脂的色素家族，位于类囊体膜。叶绿素吸收大部分的红光和紫光，但反射绿光，所以叶绿素呈现绿色，它在光合作用的光吸收中起核心作用。

叶绿素为镁卟啉化合物，包括叶绿素a、b、c、d、f以及原叶绿素和细菌叶绿素等。叶绿素不很稳定，光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解。酸性条件下，叶绿素分子很容易失去卟啉环中的镁成为去镁叶绿素。叶绿素有造血、提供维生素、解毒、抗病等多种用途。

叶绿素含量的测定

取新鲜植物叶片(或其它绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，去除中脉剪碎。称取剪碎的新鲜样品2g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。

取滤纸1张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗，滤液流至100ml棕色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至100ml，摇匀。取叶绿体色素提取液在波长665nm、645nm和652nm下测定吸光度，以95％乙醇为空白对照。

叶绿素含量的测定及计算结果

叶绿素含量的测定及计算结果如下：

叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，可用以下联立方程求叶绿素溶液中的叶绿素a、b的含量。

D663=82.04Ca9.27Cb……………………(1)

D645=16.75Ca45.6Cb……………………(2)

式中D663、D664分别为波长663nm和645nm处测定叶绿素溶液的光密度；Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(g/L)；82.04、9.27分别为叶绿素a、b在波长663nm时的比吸收系数，16.75、46.6分别为叶绿素a、b在波长645nm时的比吸收系数。

解联立方程(1)、(2)则得：

Ca=0.0127D663-0.00269D645……………(3)

Cb=0.0229D645-0.00468D663……………(4)

如把叶绿素含量单位由g/L改为mg/L，(3)、(4)式则可改写为：

Ca(mg/L)=12.7D663-2.69D645…………(5)

Cb(mg/L)=22.9D645-4.68D663…………(6)

叶绿素总量C(mg/L)=CaCb=20.2D6458.02D663……(7)

叶绿素总量也可根据下式求导

D652=34.5×C……………(8)

652nm为叶绿素a与b在红光区吸收光谱曲线的交叉点(等吸收点)，34.5为叶绿素a、b在波长652nm处的吸收系数。

DC=D652/34.5(g/L)Cd

DC=D652×1000/34.5(mg/L)………(9)

因此，利用(5)、(6)式可分别计算叶绿素a与b含量，利用(7)式或(9)式可计算叶绿素总量。

叶绿体色素的提取液中除含有叶绿素a与b外，还含有叶黄素和胡萝卜素，因为叶黄素和胡萝卜素的吸收光谱均在蓝光区，故不会干扰叶绿素含量在红光区的分光光度法测定。

叶绿素ab含量的测定注意事项

注意事项

1、由于植物子叶中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%。

2、由于叶绿素A，B的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。

实验原理：在叶绿素a和b的吸收光谱曲线中，红波波长范围内，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b的最大吸收峰在645nm。

实验步骤

1、 取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。

2、 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。

3、取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

4、 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。

5、把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。