小rna测序(小RNA测序分析)

small RNA测序的详细内容

Small RNA是一大类调控分子，几乎存在于所有的生物体中。Small RNA包括：miRNA、ncRNA、siRNA、snoRNA、piRNA、rasiRNA等等。Small RNA通过多种多样的作用途径，包括mRNA降解、翻译抑制、异染色质形成以及DNA去除，来调控生物体的生长发育和疾病发生。Small RNA转录组测序是鉴定和定量解析small RNA的新方法和有力工具。
Roche GS FLX Titanium 、Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID 4均可以对Small RNA进行大规模测序分析， Illumina Solexa GA IIx 和ABI Solid的读长正好配合了small RNA的短序列且通量大，可以得到更高的覆盖率， Illumina Solexa GA IIx在small RNA测序中广泛应用。
通过对Small RNA大规模测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的Small RNA图谱，实现包括新Small RNA分子的挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、Small RNA聚类和表达谱分析等科学应用。
一、small RNA测序样品要求
(1) 样品纯度要求： OD值应在1.8至2.2之间；电泳检测28S:18S至少大于1.5。
(2) 样品浓度： total RNA浓度不低于750 ng/μg；提取总RNA时请不要使用过柱法提取总RNA，样品总量不低于40 μg (Small RNA: total RNA大于0.3%)。或提供浓度大于2 ng/μg，总量大于180 ng的Small RNA样品。
(3) Small RNA样品请置于-20℃保存；请提供Small RNA样品具体浓度、体积、制备时间、溶剂名称及物种来源。请同时附上QC数据，包括电泳胶图、分光光度或Nanodrop仪器检测数据。如需进行多次样品制备，需要提供多次样品制备所需样品。
(4) 样品运输：样品请置于1.5 ml管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管口使用Parafilm封口。建议使用干冰运输，并且尽量选用较快的邮递方式，以降低运输过程中样品降解的可能性。
二、Small RNA分离的方法
现行的RNA纯化方法包括有机溶剂抽提+乙醇沉淀，或者是采用更加方便快捷的硅胶膜离心柱的方法来纯化RNA。由于硅胶膜离心柱通常只富集较大分子的RNA(200 nt以上)，Small RNA往往被淘汰掉，因而不适用于Small RNA的分离纯化。有机溶剂抽提能够较好的保留Small RNA，但是后继的沉淀步骤比较费时费力。目前还有另外一些Small RNA分离专用的试剂盒。如MirVana miRNA Isolation Kit是采用玻璃纤维滤膜离心柱(glass fiber filter，GFF)，既能够富集10 mer以上的RNA分子，又兼备离心柱快速离心纯化的特点。
对于Small RNA测序，我们采用PAGE胶电泳对小RNA进行分离。客户可以选择他们感兴趣的Small RNA长度进行研究。Small RNA的长度为18-30nt。我们推荐的测序长度为35bp，之后对序列信息进行修剪，去除接头序列仅留下Small RNA序列。
三、Small RNA测序文库的构建方法及质量控制
由于Solexa的读长足够满足Small RNA测序的读长要求，且数据读取量大，性价比高，因此Solexa在Small RNA测序方面得到广泛的应用。采用Solexa进行Small RNA测序其文库构建方法如下：
(1) PAGE胶纯化特定大小的小RNA分子；
(2) 5′接头连接和纯化；
(3) 3′接头连接纯化；
(4) RT-PCR扩增；
(5) Small RNA文库的纯化；
(6) 文库的检测。Small RNA文库需要通过电泳检测和Agilent Technoligies 2100 分析仪检测以分析测序文库中片段的大小、纯度和浓度。
四、高通量测序研究sRNA 优势
目前研究Small RNA的方法主要是通过实时定量PCR以及基因芯片技术，这些方法主要关注microRNA的表达和定量，并仅局限与研究那些序列信息或二级茎环结构信息已知的Small RNA，无法寻找和发现新的Small RNA分子。基于高通量测序技术的Small RNA测序技术突破了目前研究技术手段上的局限性，使研究人员能够直接对样本中的Small RNA进行高通量测序，其主要优势有：
(1) 可以直接从核苷酸水平上研究Small RNA分子，不存在传统芯片杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题，非常利于区分相同家族以及序列极为相似的不同Small RNA分子；
(2) 可以对任意物种进行高通量分析，无需任何预先的序列信息以及二级结构信息【中国测序论坛】；
(3) 灵敏度高，测序通量大，为Small RNA分子的发现和研究提供了极大的数据深度与覆盖率，能够检测丰度极低的稀有转录；
(4) 测序产生的原始数据可以与多种分析软件兼容，可以注释Small RNA的基因组信息，并分析其表达水平，能够随时使用公用Small RNA数据库注释已知的Small RNA，还可以进一步分析未匹配的数据，发现新的Small RNA种类及异构体，寻找更深入的研究信息。
五、Small RNA测序的影响因素
(1) 客户提供样本的质量，进行Small RNA测序过程中，需要对Small RNA进行分离，分离Small RNA的质量和纯度直接影响测序结果。由于RNA容易降解，因此RNA的抽提、纯化等操作一定要严格按照实验要求进行，以保证样品的质量。
(2) 构建文库的质量：文库构建需要PAGE胶分离纯化Small RNA，然后连接接头进行纯化后才能进行RT-PCR，在此过程中，要小心操作保证Small RNA无降解，同时纯化过程要保证接头去除干净，残余的接头会对后续的测序产生影响。
(3) 测序文库的上样量控制：这个因素也会很大程度影响簇生成的密度，由于上样量非常小，只有1-8 pg，所以能否准确定量微量样品也成为影响测序通量的重要因素。

small RNA测序的原理简介

Small RNA（micro RNAs、siRNAs和 pi RNAs等）是生命活动重要的调控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。Illumina能够对细胞或者组织中的全部Small RNA进行深度测序及定量分析等研究。实验时首先将18-30 nt范围的Small RNA从总RNA中分离出来，两端分别加上特定接头后体外反转录做成cDNA再做进一步处理后，利用测序仪对DNA片段进行单向末端直接测序。通过Illumina对Small RNA大规模测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的miRNA图谱，实现包括新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、miRNAs聚类和表达谱分析等科学应用。

正常的转录组测序包含小rna吗

有专门针对小RNA进行测序的，采用高通量测序技术，一次性获得单碱基分辨率水平的数百万条小RNA序列信息，依托强大的生物信息分析平台，鉴定已知小RNA，并预测新的小RNA及其靶标基因。

转录组测序的方法很多，而RNA-q是当前转录组测序的一种测序方法，又称为二代测序，包括454，solexa等。RNA-q即转录组测序技术，就是把mRNA,smallRNA,and NONcoding RNA等或者其中一些用高通量测序技术把它们的序列测出来。反映出它们的表达水平。

样品要求：

⑴样品纯度要求： total RNAOD值应在1.8至2.2之间；电泳检测28S：18S至少大于1.5。

⑵样品浓度： total RNA浓度不低于400ng/ul；样品总量不低于15ug；最新的样品建库要求降低到1ug，浓度大于50ng/ul即可。

⑶请提供total RNA样品具体浓度、体积、制备时间、溶剂名称及物种来源。请同时附上QC数据，包括电泳胶图、分光光度或Nanodrop仪器检测数据。如需进行多次样品制备，需要提供多次样品制备所需样品。

第3周：利用大豆小RNA图谱鉴定来自编码基因区的phasiRNA

理解为产生phasiRNA的PHAS位点与编码蛋白的基因区有重叠可能更准确。
侵删

  小RNA是一类普遍存在的，多功能的抑制物，包括（1）microRNA（miRNA），由mRNA形成的茎环结构加工而成; （2）小干扰RNA（siRNA），在植物中通常由需要依赖RNA的 RNA聚合酶的过程衍生。我们构建并分析了大豆小RNA的表达图谱，鉴定了超过500个产生21个核苷酸的phad siRNAs（phasiRNA;来自PHAS位点）的位点，其中483个与注释的蛋白质编码基因有重叠。 通过整合miRNA与RNA end（PARE）数据的分析，检测到127个PHAS位点上的20个miRNA靶标 。 PHAS位点的主要类别（208，占41％）与NB-LRR基因相对应；这些小RNA中的一部分优先在根瘤中积累。在PHAS位点中，还观察到TAS3的新代表和非经典相位模式。由miR4392触发的非编码PHAS位点优先在花药中积累；预测phasiRNA靶向转座因子，在大豆生殖发育中具有峰值丰度。因此，phasiRNA在双子叶植物中显示出巨大的多样性。我们鉴定了新的miRNA并评估了miRBa中记录的大豆miRNA的准确性，显着改善了大豆miRNA注释，促进了miRBa注释的改进并鉴定了高严谨性的新miRNA及其靶标。

文章做了些什么：

   小非编码RNA在发育，细胞分化，适应生物和非生物胁迫以及基因组稳定性方面具有重要作用。 小RNA的主要活性是通过靶标降解，翻译抑制或通过指导染色质修饰来对特定mRNA或基因表达模式进行负调控。迄今已鉴定出几种不同类型的小RNA。在植物中，研究最多的小RNA是microRNA（miRNA）和小干扰RNA（siRNA）;这些是由不同的前体和不同的途径产生的。 通常长度为21至22个核苷酸的miRNA 衍生自通过RNA聚合酶II从MIRNA基因转录的长非编码RNA前体。miRNA前体形成由DICER-LIKE1（DCL1）或其他DCL酶（极少数）加工的茎环结构，产生3’具有两个核苷酸突出的单个小RNA双链体（miRNA / miRNA *）。小RNA双链体的一条链是成熟miRNA，被称为引导链，它会结合到Argonaute（AGO）蛋白上以形成效应复合物（所谓的用于RNA诱导的沉默复合物——RISC），其指导miRNA靶标降解或翻译抑制。双链体的另一条链，即miRNA *或pasnger strand，迅速降解，通常不会积累。 siRNA通常来自完全互补的长双链RNA（dsRNA）前体，这些前体一般由RNA依赖性的RNA聚合酶（RDR）形成，也可能由退火了的正义/反义转录物形成。已经在植物中定义了几类siRNA，主要类别是异染色质siRNA，它在胞嘧啶甲基化和抑制性组蛋白修饰的建立和维持中起关键作用。 siRNA还能够作为移动信号起作用，通过siRNA的运动使沉默效应从细胞扩散到其它细胞或更长距离。

  科学家已经鉴定了一类相当有趣的siRNA，它们是长双链RNA前体以21个核苷酸为增量来逐步裂解的产物，产生定相的或完全间隔排列的小RNA。这些siRNA，即所谓的相位排列siRNA（phasiRNA），由特定的引导miRNA切割而产生，遵循单击或双击模式，分别对应一个22nt或两个21nt的miRNA的靶位点。切割的未加帽的mRNA产物用作RDR6的底物，产生dsRNA前体，然后被DCL4切割以产生21-核苷酸的定相siRNA。 一些定相siRNA已经显示在靶基因的反式调节中起作用;因此，这类siRNA最初被称为tasiRNA，但是更多的基因位点产生具有未知反式作用的相同相位模式（PHAS基因座）的siRNA，因此一般用“phasiRNA”进行描述。 tasiRNA通过对互补靶位点进行切割来调节mRNA，这如同许多植物miRNA一样。 最着名的tasiRNA是由TRANS-ACTING SIRNA GENE3（TAS3）产生的反式小干扰RNA-生长素响应因子（tasiARF）的集合。tasiARF在抑制生长素响应因子基因（ARF2，ARF3 / ETTIN和ARF4）中起作用 。已经在许多植物物种中鉴定出许多phasiRNA，包括拟南芥，水稻（Oryza sativa）和葡萄（Vitis vinifera）。已知PHAS基因座的数量在物种之间差异很大，从野生稻（Oryza rufipogon）中的800多个到拟南芥中的不到30个。在豆科植物中，分别在Medicago truncatula和大豆（Glycine max）中鉴定出114和41个PHAS基因座。

  大豆在经济上是世界上最重要的豆类，它是蛋白质和食用油的主要来源之一。大豆的基因组序列现在可公开获得。基因组序列与下一代测序技术产生的数据一起，使得能够在全基因组范围内鉴定和定量小RNA。迄今为止，已在大豆中鉴定出数百种miRNA。然而，许多新注释的miRNA及其靶标尚未得到很好的验证，甚至注释的miRNA也经常在更强大的实验数据后进行校正。PHAS基因座比miRNA的注释更差。与Medicago truncatula相比，在大豆中鉴定出的PHAS位点要少得多。凭借广泛的小RNA数据和更高的测序深度，可以发现更多的PHAS。在这项研究中，我们分析了从不同组织中创建的大量小RNA文库，以构建小RNA的表达图谱并全面鉴定大豆中的PHAS基因座。 我们证明大豆中的许多蛋白质编码基因是PHAS基因座。 除了先前被鉴定为豆科植物PHAS基因座的NB-LRR之外，我们发现了数百种其他产生phasiRNA的蛋白质编码基因。 我们整合了RNA末端（PARE）数据的并行分析，以确定这些PHAS基因座的miRNA触发因子。 从这些数据中，我们验证了在miRBa（版本20）中记录的大豆miRNA并且鉴定了新的miRNA，证明了许多先前报道的miRNA具有siRNA的特征。基于表达分析，我们证明了phasiRNA以及已知和新发现的miRNA在不同组织和不同处理下的特异性表达。

总结

重点是流程图和过滤条件

探究了不同组织（或组织组合）中的miRNA富集差异。

图1.新的和组织优先miRNA的表达谱。
（A）在该研究中鉴定的新miRNA包括许多在特定组织或器官中差异富集的miRNA。
（B）对先前描述的大豆miRNA的分析还揭示了花，叶和根瘤中一系列的组织bias。

图2.编码蛋白质的PHAS基因。
比起其他研究过的植物基因组，大豆基因组含有更多的编码蛋白质的产生phasiRNA的基因座。
（A）编码PHAS基因座的类别和数量。
（B）NB-LRR家族中PHAS基因的表达谱和层次聚类。
（C）大豆基因组中phasi-NB-LRR基因的分布和聚类。

图3.大豆TAS3 TasiRNA的触发物和加工机制。
（A）来自大豆基因组中存在的六个TAS3基因座中的tasiRNA的总和在花，叶，根瘤和种子组织中的富集模式。 TAS3a和TAS3b是相同的，因此不能单独测量。
（B）源自TAS3a / b / c / d / e / f的TasiARF。所有TAS3 598D（+）和597D（+）siRNA的验证目标均在生长素响应因子（ARF）家族中，与其相对良好的保守序列一致（数据未显示）。
（C）在大豆TAS3基因座处存在两个或三个miR390靶位点，并且相对于这些靶位点的定相方向表明在TAS3e和TAS3f处由21个核苷酸的miRNA触发的siRNA的非典型加工方向。

图4.由TasiARF触发的ARF3 PHAS-Locus。
（A）大豆TAS3衍生的tasiARF在两个相同的位点靶向ARF3，通过PARE验证切割的59位点（下图）和未观察到切割的39位点。这种双击的tasiARF活性产生了定相siRNA（中图）。 y轴是phasing “score”，其是定相显著性的估计P值（ 参见方法 ）。 较低的两个图像是我们的Web浏览器，显示小RNA（中间）或PARE数据（下部），橙色虚线表示tasiARF切割位点。有色斑点是在y轴上显示丰度的小RNA ；浅蓝色斑点表示21个核苷酸的sRNA，绿色表示22个核苷酸的sRNA，橙色表示24个核苷酸的sRNA，其他颜色对应其他sRNA大小。红色框是带注释的外显子（粉红色是非翻译区域）。紫色线表示重复区的k-mer频数。
（B）来自图A的数据表明two-hit的phasiRNA生物发生的级联反应，其中21个核苷酸（nt）miR390触发21个核苷酸的tasiARF生物发生，并且通过two-hit机制，tasiARF触发来自ARF3和ARF4的额外二级siRNA的生成（参见补充图7在线）。 ARF siRNA可以顺式或反式起作用。

图5.源自Arogenate脱氢酶基因座的花药中高度富集的PhasiRNA。
（A）涉及雄激素脱氢酶的生化途径。
（B）来自雄激素脱氢酶相关基因座的phasiRNA产生的示意过程。在左侧，将形成发夹的基因片段加工成phasiRNA。
（C）来自不同组织中的两种arogenate dehydrogena PHAS基因的miRNA触发物和phasiRNA的reads丰度水平（红色条）和基因表达水平（绿色条），其被标准化为RP5M和RP25M。

如何确定有没有匹配到tRNA，rRNA，snRNA和snoRNA？

降解组测序： http://www.ebiotrade.com/custom/LC_BIO/100427/index.htm

RNA的测序原理及方法！^~^

DNA和RNA的测序方法

DNA或RNA碱基序列测定方法，包括步骤：
1）将DNA或RNA单链固定于平面支持物上；
2）将一束激光聚焦于一条固定化的单链上；
3）通过加入含有（i）用于合成DNA互补链的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶四种核苷酸的混合物或用于合成RNA互补链的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶四种核苷酸的混合物和（ii）一种聚合酶的溶液，用来产生上述被固定的、被聚焦的单链的DNA或RNA互补链，插入到互补链中的每一个被发光标记物标记了的核苷酸用单分子检测器进行检测，以及在下一个被发光标记物标记的核苷酸插入之前对前一个被发光标记物标记的核苷酸的发光信号进行检测。