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图解blast验证引物教程

——以文献报道的人类的ABCG2的引物为例

1、进入网页：/BLAST/

2、点击BasicBLAST中的nucleotideblast选项

3、完成2操作后就进入了BasicLocalAlignmentSearchTool界面

（1）在EnterQuerySequence栏中输入引物序列：

注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;

5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’

简便的做法是同时输入上下游引物。输入上下游引物系列都从5’—3’。输入上游引物后，

加上≥20个字母n，再输入下游引物，如下图：

生

物

秀

（2）在ChooSearchSet栏中：

Databa根据预操作基因的种属定了，本引物可选Humangenomic+transcript

或Others(nretc.)。本人倾向于选后者，觉得此库信息更多。如下图：

（3）在ProgramSelection中：选择Somewhatsimilarquences(blastn)项，如下图：

（4）在此界面最下面：如下图

生

物

秀

-

专

心

做

生

物

w

w

w.

b

b

i

o

o

.

c

o

m

Showresultsinanewwindow项是显示界面的形式，可选可不选，在此我们选上了。关键

要点击Algorithmparameters参数设置，进入参数设置界面。

4.参数设置：

（1）在GeneralParameters中：Expectthresshold期望阈值须改为1000，大于1000

也可以；在Wordsize的下拉框将数字改为7。如下图：

（2）ScoringParameters无须修改

（3）FiltersandMasking中，一般来说也没有必要改

5．点击最下面一栏的BLAST按钮，如图：

6.点击BLAST按钮后，跳转出现如下界面：

7.等待若干秒之后，自动跳转出现显示BLAST结果的网页。该网页用三种形式来显示blast的

结果。

生

物

秀

-

专

心

做

生

物

w

w

w.

b

b

i

o

o

.

c

o

m

（1）图形格式：

图中①代表这些序列与引物匹配的得分值小于40分

图中②代表这些序列与引物匹配的得分值位于40～50分

图中③代表这些序列与引物匹配的得分值位于80～120分，

分值越高，特异性越好。线段代表上或下游引物，其颜色和上面对照后就可得出该条引物的

分值。

图中两线段间有连线的代表这些序列与上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并与下游引

物互补（Strand=Plus/Minus），理论上可以扩增出基因片断。没有连线的，表示单条引物与

该基因一致。

点击线段，就能跳转到该基因的结果信息概要。

（2）结果信息概要：

Accession、数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息

Desscription、系列的简单描述

Totalscore高的就是有两线段间有连线的，如图划线的。

Evalue：代表被比对的两个序列不相关的可能性。【TheEvaluedecreaxponentiallyas

theScore(S)thatisassignedtoamatchbetweentwoquencesincreas】。E值最低的

最有意义，也就是说序列的相似性最大。设定的E值是我们限定的上限，E值太高的就不显

示了

E、最后一栏有的有UEG的字样，其中：

U代表：Unigene数据库

E代表：GEOprofiles数据库

G代表：Gene数据库

（3）结果详细信息：

生

物

秀

-

专

心

做

生

物

w

w

w.

b

b

i

o

o

.

c

o

m

划线上代表上游引物与该序列的正链【Plus/Plus】的匹配情况：

划线下代表下游引物与该序列的负链【Plus/Minus】的匹配情况：

共有20个碱基匹配，得分40.1分【20×2＋0.1＝40.1】，E值为0.077。

为什么与上下游引物匹配的ABCG2序列有多种？

A、为同一个基因来源的不同的mRNA片段

B、为该基因的DNA系列

C、为同一个基因来源的不同的cDNA克隆片段。

结果判断：

①验证文献报道的引物是否正确：如果你可以在所显示的结果中找出你的目的基因，一般说

明你的引物正确性没问题。如果你blast后没有发现你的目的基因，或者分值很低，该引物就

可能不适合用

②检测该对引物是否可与其它序列匹配，引起PCR的非特异性扩增。如果找到了你的目的

基因名称，而且找到了一大批同物种的不同基因，（上下游引物分别搜索到相同的基因），而

且分数也较高。这时表明你的引物设计的特异性不高，极有可能在你的扩增产物中出现非特

异性产物。

生

物

秀

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心

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生

物

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w

w.

b

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o

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