粘蛋白

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蛋清卵类粘蛋白的分离纯化

一．实验器材

1.仪器：pH计、恒温磁力搅拌器、蛋白质核酸分析仪、自动部份收集器、梯度混合器、层

析柱、紫外可见光分光光度计、真空冷冻干燥机、电泳仪、电泳槽、恒温震荡摇床、透析

袋、冷冻离心机、真空干燥箱、分析天平

2.试剂：新鲜鸡蛋、SephadexG-25凝胶填料、DEAE-32纤维素离子交换填料、卵类粘蛋白中药止咳

标品、三氯乙酸(TCA)、丙酮、氯化钠、NaH

2

P0

4

、Na

2

HP0

4

、考马斯亮蓝G-250、考马斯亮

蓝R-250、丙烯酰氨、过硫酸胺、甘氨酸、Tris-ba、十二烧基硫酸钠、乙醇、冰醋酸、

碳酸氧钠、氯化铁、硫酸胺

3.主要溶液的配制及材料的处理：

10%三氯醋酸(pH1.15):先把称好的TCA加总体积2/3的水溶解,再用10mol/LNaOH调节

pH至1.15,最后加水至所需体积。

0.02mol/L,pH6.5磷酸缓冲液:先配成10倍的母液,用时稀释至0.02mol/L;

磷酸氧二钠-磷酸二氧钠缓冲液(0.02mol/L,pH6.5,25℃）配制方法:

0.2mol/L磷酸氢二钠:Na

2

HP0

4

12H

2

071.64g/1000mL,31.5mL;

0.2mol/L磷酸二氧钠:NaH

2

P0

4

2H

2

031.21g/1000mL,68.5mL;

胰蛋白酶标准液(0.5mg/mL):用0.001mol/LHCl配制(每次50ml,用完再配);

BAEE底物缓冲液(内含0.05mol/LCaCb):用0.05mol/L的Tris-HCl溶解,调pH至7.8;

1mmol/LBAEE底物溶液:34mgBAEE定容至100mL底物缓冲液中,临用前配置。

SephadexG-25葡聚糖凝胶层析填料的处理:称取30gSephadexG-25,用0.02mol/L,pH6.5

磷酸缓冲液500mL热溶胀2h或者室温怎样成为学霸 溶胀24h。脱气后装柱。

DEAE-32纤维素离子交换填料的处理:称取DEAE-纤维素粉(DE-32)10g,以150mL0.5

mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl溶液浸泡20min,转移到布氏漏斗中抽滤,用蒸馏水洗至中性(大

约pH8.0),抽去水分,移至烧杯中,再用150mL0.5mol/LHCl浸泡20min,然后移至布氏漏斗中

抽滤,以蒸馈水洗至中性(大约pH6.0)。最后倒在烧杯中用150mL0.02mol/L,pH6.5磷酸缓

冲液浸泡片刻。于真空干燥器内脱气,装柱。

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二．实验方法

粗品的制备

1.1TCA沉淀杂蛋白

取50mL鸡蛋清,加等体积的10%三氯醋酸(pH1.15)溶液,这时出现大量的白色沉淀,搅拌均匀

后在pH酸度秋天的雨作文 计上检查pH值,此时的pH值应是3.5。若提取液的pH值偏离pH3.50.2,则

要用5mol/LNaOH或5mol/LHCl把pH值调回到pH3.50.2的范围以内。由于提取液非常

粘调,要防止局部过酸或过碱。调好pH值后,在室温下静置4h以上。

1.2离心去除杂蛋白沉淀

待清蛋白完全沉淀后,以3000r/min离心10m超级恋人动漫 in。弃去沉淀物,上清再用滤纸过滤。以滤除上

清液中的脂类物质及其他不溶性物质。

1.3冷丙酮沉淀CHOM粗品

收集滤液转移到一个烧杯里。检查滤液的pH值是否是pH3.5,若相差较大要调回到pH3.5。

放置冰浴中冷却片刻,缓慢加入3倍体积的预冷丙酮(放在冰箱的冷藏室预冷)。用玻璃棒轻轻

揽匀。用塑料薄膜盖好,尽量减少丙酮的挥发。在冰浴里放置4h以上。

1.4离心收集CHOM粗品并除残留丙酮

待CHOM完全沉淀后,以4000r/min离心5min,倾出上清夜。将沉淀物放在真空干燥器类,

抽气除去残留丙酮。然后用20mL蒸馏水溶解(若溶解液浑油,则用滤纸除去不溶物),即得

CHOM粗提液。

exG-25层析柱脱盐

取20mLCHOM粗提液上柱脱盐(上样量不超过柱床体积的1/6)。用0.02mol/L,pH6.5磷酸

缓冲液平衡并洗如何调戏男朋友 脱。收集洗脱峰。

-32纤维素离子交换法纯化CHOM

将经SephadexG-25脱盐的CHOM粗提液上柱吸附。用0.02mol/L,pH6.5磷酸缓冲液淋洗

去除杂蛋白。流出液在核酸蛋白检测仪上绘出稳定的基线。然后改用0.3mol/LNaCl-0.02

mol/L,pH6.5磷酸缓冲液洗脱。并收集活性峰。

纯品的制备

4.1透析除盐

将上述收集到的溶液全部装入透析袋内。用蒸馏水进行透析。间隔一段时间更换一次蒸傾水,

3

直到用l%AgN03检查无氯离子为止。

4.2调整透析液的pH及冷丙酮沉淀CHOM纯品

将透析液转移到烧杯里,用1mol/LHC1调节至pH4.0,然后加入3倍体积的预冷丙酮。盖上

塑料薄膜,在冰浴里静置4h以上。

4.3CHOM纯品的离心和干燥

待CHOM全部析出后,倾出上清,剩余的沉淀物于4000r/min离心5min。弃去上清夜,沉淀物

干燥,就得到透明胶状物一CHOM纯品。

5.产品鉴定与纯度

5.1十二烷基硫酸钠-聚丙燭酷胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

浓缩胶浓度5%,分离胶浓度12%。样品(2mg/mL)溶于上样缓冲液,上样量10uL,浓缩胶电泳恒

压80V,分离胶电泳恒压120V。凝胶用50%乙醇和10%冰醋酸固定30min,0.1%考马斯亮蓝

R-250染色30min,25%乙醇和8%冰醋酸混合液进行脱色。

6.总蛋白含量测定

以牛血清白蛋白为标准蛋白质,用考马斯亮兰法测蛋白质含量。具体操作步骤如下:

6.1标准曲线的绘制

取7只干净试管,编号,并胺照下表所示加入试剂、混匀,室温静置3min,以第一管为空牛的谚语 白在

595nm波长下测定读取吸光度值,以吸光度为纵坐标,各标准液浓度为纵坐标绘图得标准曲

线。

编号1(空白)234567

标准蛋白液加入量/mL-0.10.20.30.40.60.8

0.9%NaCl加入量/mL1.00.90.80.70.60.40.2

考马斯亮蓝染液加入量/mL4.04.04.04.04.04.04.0

蛋白质浓度(Hg/mL)0

A595nm

6.2待测样品的测定

取一只千净试管,加入1.0mL样品液及4.0mL考马斯亮蓝染液、混匀戒酒硫 ,室温静置3min,于波长

595nm下比色读取吸光度值。由标准曲线查得待测液中蛋白质含量。

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