结香

国药沉香结香真菌的分离鉴定及分析

马华明;梁坤南;周再知;杨伟

【摘要】对采自广东省电白县的土沉香分创伤组和结香组进行真菌分离培养,通过

rDNA中内转录间隔区(ITS)序列鉴定其为10个种.从创伤组来看,创伤短期之内,其

真菌种类出现了增多的现象,这一阶段是始结香的前期,大量的致病菌的侵染可能导

致结香的发生,创伤结香过程与致病菌有着必然联系.从结香组来看,未结香、始结香

和已结香部分的真菌种类则依次减少,始结香部分和已结香部分的的真菌多数相同,

包括多变根毛霉Rhizomucorvariabilis、再育镰刀菌Fusariumproliferatum和

哈茨木霉Hypocrealixii,这些真菌能促进沉香的形成.%Thefungiwereisolated

fromtwogroupsofsamplesofAquilariasinensisat溺水手抄报 Dianbai,Guangdong

province,gi

oundthat

thepathogenicfungispeciesincreadquicklyintheshorttimeafterthe

hownthatthepathogenicfungiwerecorrelativewith

agarformation,inanotherword,thepathogenicfungalinfectionwould

er,thefungispecies

wereanalyzedbadonagarwoodgroup,whichwasdividedintothree

partsincludingno-agarwood,little-agarwoodandagarwood,itwas

foundthatthepathogenicfungispeciesnumberwasthemaximuminthe

no-agarwoodpart,andthe易拉罐画 pathogenicfungispeciesnumberswerefewer

fungiinthelittle-agar

giandRhizomucor

variabilis,Fusariumproliferatum,andHypocrealixiiplayedanimportant

roleinagarformation.

【期刊名称】《中南林业科技大学学报》

【年(卷),期】2012(032)007

【总页数】4页(P72-75)

【关键词】土沉香;真菌;分子鉴定;ITS区

【作者】马华明;梁坤南;周再知;杨伟

【作者单位】中国林业科学研究院热带林业研究所,广东广州510520;中国林业科

学研究院热带林业研究所,广东广州510520;中国林业科学研究院热带林业研究所,

广东广州510520;中国林业科学研究院热带林业研究所,广东广州510520

【正文语种】中文

【中图分类】S759;Q949.761.1

土沉香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg.又名白木香、莞香、女儿香，是瑞香科

Thymelaeaceae沉香属云上太阳 Aquilaria木本植物，为国家二级濒危保护植物。土沉香

是我国生产名贵中药材沉香的唯一来源，在我国药用历史悠久。此外，在日本、印

度以及东盟国家，沉香也是传统名贵药材和天然香料。我国中医认为，其味辛、苦，

性微温，能行气止痛、温中止呕、纳气平喘[1]。瑞香科Thymelaeaceae沉香属

Aquilariaspp.的部分种和拟沉香属Gyrinopsspp.的部分种，经人为或自然方式

使其树干木材组织在胁迫条件下发生生物化学过程，酯类物质逐渐增多并积累于木

材中，形成了沉香，这一过程又被称为结香。能生产沉香的植物统称沉香木，印度、

中国、东南亚是沉香的主产国，栽培最为广泛的沉香木有马来沉香A.

malaccensis、奇楠沉香a和我国的土沉香is。

由于沉香形成过程极其复杂，国内外的学者都做了很多研究。国外早期的研究认为，

沉香的形成可能是树干受到伤害后被真菌侵染，真菌的代谢产物使木材薄壁细胞的

淀粉粒发生生物化学变化，形成脂类，经多年沉积而形成沉香[2-3]，从沉香属植

物树体的结香部位分离到的真菌种类很多，包括砖红镰孢Fusariumlaritum、

青霉Penicilliumspp.、曲霉Aspergillusspp.、毛霉Mucorspp.、色二孢菌

Diplodiaspp.、可球二孢菌Botryodiplodiatheobromae、木霉

Trichodermaspp.、裂褶菌Schizophyllumspp.、镰刀菌Fusariumspp.等[3-

8]。在国内，也有学告别作文 者分离出黄绿墨耳菌Menanotusflavolives[9]，并认为它与

沉香形成有关，做了大量的实验[10-12]支持其观点，但张争等[13]对这一研究成

果提出了质疑。近年来，王磊等[14]对土沉香内生真菌作了较为全面的研究，分离

出了50个菌株，但未将研究重点放在结香这一层面上。为了探索真菌在结香过程

中的变化情况，笔者精心设置了人工创伤试验，并从结香的角度分析了创伤前后的

真菌情况；还根据不同结香程度，对结香过程中的真菌类别作了阐述，本研究内容

在国内尚属首次，旨在揭示结香过程与真菌之间的关联，为将来开展结香真菌筛选

与接菌结香技术的研发奠定基础。

在广东省电白县采集试验样品，土沉香由中国林科院热带林业研究所森林培育实验

室鉴定，分离真菌所用的样品材料分为两组：A组为创伤组，即在选取胸径30

cm以上的3株成年土沉香，在树干上从离地面40cm、70cm和100cm处钻

一个直径约10cm深至髓心的水平孔，孔径2cm，钻后第0天、90天和180天

分别取一个孔周（不含表层）木材作为分离真菌的材料，代表不同创伤时间样品；

B组为结香组，选经鉴定已结香的沉香树3株，根据不同结香程度分别取样作为分

离真菌的材料，即未结香（色泽仍为白木）、已结香（与成品沉香色泽一致）和始

结香（位于未结香和已结香之间的过渡带，色泽较成品沉香浅），代表不同结香程

度样品。样品自植物体取下后，用无菌水反复冲洗，再用滤纸吸干样品表面的水分，

用密封袋装好后带回实验室。

预先备好用于分离真菌的综合PDA培养基。取回的样品需先在0.1%的HgCl2溶

液中浸泡1min，取出用无菌水冲洗，再用75%乙醇中浸泡1min和无菌水冲洗，

然后在超净工作台将样品放入备好的培养皿。将培养皿置于26℃恒温培养箱，

待形成菌落后，根据菌落特征，挑取单一菌落的菌丝转接至新的培养皿，继续在

26℃下恒温培养。经多次分离直到纯化，所获菌株转接试管保存备用。

从培养皿上挑取少量菌丝体移入已灭菌的1.5mL微型离心管中，加入30L尿素

提取液(1.5%SDS，7mol/L尿素，0.05mol/LTris-HC1pH8.0，0.5mol/L

NaCl)，捣碎材料，然后将材料置于液氮中冷却，再取出继续捣碎至融化，如此反

复3次。之后，加入尿素提取液300L，在液氮中冷却后置于65℃迅速融化，反

复冻融3～4次后，再加入等量的V(酚)∶V(氯仿)∶V(异戊醇)=25∶24∶1，在13

000r/min下离心10min。取上清液加入等量(氯仿)∶V(异戊醇)=24∶1，于13

000r/min下离心10min。再取上清液，加入微量RNaA，置于37℃恒温箱

中30min。最后，加入3倍体积无水乙醇，3mo/LNaAc(pH5.2)，在-20℃放

置30min以上后，13000r/min离心15min。取沉淀物，分别用70%乙醇和

无水乙醇洗涤，风干后加入50LTE回溶。取1L回溶液在1%诗经楚辞起名汇总 的琼脂糖凝胶上

作电泳检查，其余置于-20℃下保存备用。

通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG摘抄好段 -3'，正向)和ITS4(5'-

TCCTCCGCTrATrGATATGC-3'，反向)扩增分离菌株的rDNA内转录间隔区(ITS

区)，采用ExTag(TaKaRa)进行PCR反应。反应条件:首先，93℃预变性3min；

然后，93℃变性1min，53℃复性1min，72℃延伸1.5min，共30个循环；

最后，72℃延伸10min。

用PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN)纯化反应产物，纯化后则用TagI及HhaI2种

限制性内切酶(TaKaRa)进行酶切分型，依分型结果进行测序。

运行blast程序，对测序所获序列在GenBank上进行相似性检索，根据blast结

果，确定分离菌株的种类。对于无法确定的分离株，将其序列以及近似序列导入

MEGAversion3.1[15]中进行比对，采用邻位互换算法(CNI)搜索最小进化树(ME

tree)，并进行l000次重复的自展检验(bootstrap)，ME树上与之最接近的种类

则为分离菌株可能的种类。

土沉香树干经创伤后，随着时间的推移，在伤口无法愈合的情况下，会形成沉香，

但这是一个缓慢的过程并受当地环境影响，时间的长短并不确定。在本试验中，创

伤180d时仍处于未形成沉香的阶段。

从表1中可以看出，创伤0天（即未创伤）时，样品中仅分离出哈茨木霉

Hypocrealixii。哈茨木霉是一种植物益生菌，除了它的代谢产物有助于植物对水

分和养分的吸收外，它还是一个菌寄生真菌，被广泛应用于植物真菌病害防治，它

至少可寄生于18个属中的29种植物病原真菌，哈茨木霉菌主要通过识别寄主后

缠绕寄主真菌的菌丝，随后产生细胞壁降解酶和抗生素以及对空间和营养的竞争机

制达到防治植物病原菌的目的[16-17]。正常生长的土沉香素有“百年白木”之说，

或许跟存在哈茨木霉有一定的关联。创伤90天后，除了哈茨木霉，还出现了一个

致病菌—可可毛壳色单隔孢Lasiodiplodiatheobromae，而创伤180d后，还

出现了茄病镰刀菌Fusariumsolani、弯孢菌Curvulariaspp.和小孢拟盘多孢

Pestalotiopsismicrospora这3个菌种，这3个菌种均为致病菌。综上所述，当

土沉香受到创伤之后致病菌会随之增加，可以推断，创伤结香过程与致病菌有着必

然联系，而且这一过程是多种致病菌共同作用的结果，由于创伤之后出现的致病菌

在未创伤树干组织并未发现，推断这些致病菌是通过创伤伤口从外界进入的。

结香组样品中未结香部分从表观上未有结香迹象（即仍为白色），但从分离的真菌

种类来看，该部分的真类种类最多，有5种，均为致病菌（见表2）。通常，在自

然状态下，木材组织由健康白木向沉香转变的过程是一个漫长的过程，少则几年多

则几十年，结香组样品中未结香部分正处于这一变化过程中，这部分出现了多种真

菌，说明，未结香部分朝着结香方向变化需要多种真菌参与才可能发生。就真菌种

类而言，按未结香→始结香→已结香顺利依次减少，而且前者与后两者分离的真菌

大多数不是同种，这说明随着沉香物质的形成对某些真菌有一定的抑制作用，这些

真菌难以企业制度建设 生存，取而代之的是其它的真菌，但总的菌种种类会随之减少。在有沉香

物质的部分，即始结香部分和已结香部分，真菌比较接近，都发现了再育菌刀菌

Fusariumproliferatum和多毛孢菌Pestalotiopsispalmarum，均为致病菌，这

些致病菌仍能在含沉香特质的木材中生存，仍能促进沉香物质的形成。可见，沉香

的形成过程并不是某一些真菌自始至终的结果。

本试验所分离菌株通过rDNA中内转录间隔区(ITS)序列鉴定，均具有99%以上的

相似序列，其中确定至种名的有9种，仅确定至属名的有1种。

从创伤组来看，创伤短期之内，其真菌种类出现了增多的现象，但本试验只考察到

创伤180天菌种，从结香过程来看，180天仍处于未结香阶段，这一阶段是始结

香的前期，大量的致病菌的侵染才可能倒致结香的发生，这与结香组的样品菌类分

析结果是一致的，即未结香部分真菌种类较多。

从结香组来看，在有沉香物质的部分，即始结香部分和已结香部分，都发现了多变

根毛霉Rhizomucorvariabilis、再育镰刀菌Fusariumproliferatum和肉座菌

Hypocrealixii，从始结香到已结香，它们并没有由于沉香物质的增多而消亡，可

以认为它们的存在与沉香物质的增多有一定的关联性，换言之，它们促进了沉香物

质的形成。

综合创伤组和结香组的真菌种类来看，发现：(1)创伤之后的样品和结香组的样品

并不存在相同的真菌，唯一共同之处在于所分离的真菌均为致病菌，可见，沉香结

香过程与致病菌有关，可能还是多种致病菌共同作用的结果，该结论与国外的研究

一致[2-3]；(2)一旦木材组织受到创伤，侵染的真菌会呈增加的趋势，但当有沉香

物质形成以后，一些真菌会消亡，相应地真菌种类会逐渐减少。

值得一提的是，本文在结香部位所分离出的菌株与国外的研究不尽相同，可能是样

品的地域性所致，即每一样品的真菌种类与该样品所处的环境悉悉相关，但同时也

说明不同地区的沉香形成所需的微生物是不同的，换言之，沉香的形成并不是某一

特定真菌作用的结果。本文所揭示的土沉香结香与致病真菌之间的关系，对我国开

展人工接菌结香技术生产国药沉香具有一定的指导意义。

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