周永顺

绵羊DRB1基因外显子2酵母表面展示库的构建及鉴定

王元元;严国;罗成;齐江姣;谭君;周光普;周永顺;徐杰;高剑峰

【摘要】为了揭示布鲁氏菌病的致病机制并研制其新型分子疫苗,试验利用酿酒酵

母展示系统展示绵羊白细胞表面抗原DRB1基因,构建DRB1基因外显子2的酵母

表面展示库.参照GenBank中绵羊MHCⅡDRB1基因序列设计引物,以绵羊脾脏组

织cDNA为模板,反转录扩增得到预期长度的产物,双酶切连接到克隆载体pEASY-

T1,命名为pEASY-T1-DRB1.双酶切连接到表面展示载体pYD1上,成功构建了表面

展示重组质粒pYD1-DRB1.以pEASY-T1-DRB1为模板,将DRB1基因外显子2两

端进行点突变,产生新的酶切位点,然后对外显子2设计特异性引物.对500个绵羊

样本进行DNA池化,扩增DRB1基因外显子2序列,双酶切后连接到经相同酶双酶

切的表面展示重组突变载体pYD1-DRB1-TB上,构建酿酒酵母表面展示库.转化大

肠杆菌DH5感受态细胞,计算库容量.将其转化酿酒酵母EBY100感受态细胞,经

半乳糖诱导,通过免疫荧光法在荧光显微镜下检测.结果显示,绵羊DRB1基因成功整

合到酵母基因组中,酵母展示库的库容量在105个以上,DRB1基因库成功展示在酵

母细胞表面.由此说明,该库可用于下一步布鲁氏菌抗原肽的筛选.

【期刊名称】《中国畜牧兽医》

【年(卷),期】2018(045)004

【总页数】8页(P850-857)

【关键词】绵羊;DRB1基因;外显子2;点突变;酵母展示库;免疫荧光

【作者】王元元;严国;罗成;齐江姣;谭君;周光普;周永顺;徐杰;高剑峰

【作者单位】石河子大学生命科学学院,石河子832003;石河子大学生命科学学院,

石河子832003;石河子大学生命科学学院,石河子832003;石河子大学生命科学学

院,石河子832003;石河子大学生命科学学院,石河子832003;石河子大学生命科学

学院,石河子832003;石河子大学生命科学学院,石河子832003;石河子大学生命科

学学院,石河子832003;石河子大学生命科学学院,石河子832003

【正文语种】中文

【中图分类】R392.11

绵羊在中国畜牧业中占据着重要的地位，但布鲁氏菌病(brucellosis)严重影响着绵

羊养殖业的发展[1-2]。布鲁氏菌病又称地中海弛张热、马耳他热、波浪热或波状

热，是由布鲁氏菌(Brucella)引起的世界范围内的人兽共患病[3]。布鲁氏菌是一种

兼性胞内寄生菌[4]，革兰氏染色阴性。中国流行的主要有3种：羊布鲁氏菌

(Brucellamelitensis)、牛布鲁氏菌(Brucellabovis)、猪布鲁氏菌(Brucellasuis)，

其中以羊布鲁氏菌病最为多见，其次是牛种布鲁氏菌。被布鲁氏菌感染的人和动物

表现为流产及不孕不育等症状[5]。布鲁氏菌病在危害人类健康的同时，给社会的

发展带来了巨大的经济损失[6]。

酵母表面展示技术(yeastsurfacedisplay)是一种近年来把功能性蛋白或肽锚定到

酵母细胞表面的真核展示技术[7]，该系统展示的蛋白接近于生物体内的蛋白[8]。

Eric等[9]运用酵母表面展示技术，将MHCⅡ类分子DR二聚体展示于酿酒酵母表

面，用DR单克隆抗体证实其与胞内DR4分子生物学特性相同，并用它来研究抗

原肽与之结合的稳定性。酵母表面展示技术已经广泛用于蛋白质工程[10]，如蛋白

质文库的筛选、蛋白质的定向进化、抗原/抗体库的构建、抗体的分选。研究表明，

酵母表面展示系统可用于口服疫苗的研制[11]。MHC和抗原肽相互作用激活T细

胞是清除病原体的关键一步[12]，病原体经过MHCⅡ加工、递呈到细胞表面，才

能被CD4+辅助性T细胞识别，启动体液免疫反应[13-14]。MHCⅡ分子呈现在免

疫系统特定的细胞表面，是由链和链两条链非共价键组成的一组高度多态性

的跨膜糖蛋白。绵羊MHCⅡDR区基因在蛋白质水平上是可以表达的[15]，绵羊

DRB1基因在抗原递呈过程中扮演着重要的角色[16]，它与牛DRB3基因直系同源。

陈月娥等[17]采用PCR-SSCP技术对126个布鲁氏菌阴性和67个布爱情的滋味 鲁氏菌阳性

样本进行研究，结果表明，MHC-DRB1基因外显子2的多态性与绵羊布鲁氏菌病

易感性呈显著相关；Cinarab等[18]对370只绵羊DRB1基因的SNP和单倍型进

行研究，结果表明，DRB1基因的单倍型影响绵羊的生长状况和繁殖能力；

Stavros等[19]对432只绵羊进行研究，结果发现，绵羊DRB1基因外显子2具

有高度的多态性。为了便于抗原肽的筛选和布鲁氏菌亚单位疫苗的研制，本再接再厉什么意思 试验选

用了多态性较高的DRB1基因。绵羊DRB1基因含有6个外显子，其中外显子1

编码信号肽序列，外显子2编码1结构域，外显子3编码2结构域，为了尽可

能保证目的蛋白表达正确的高级结构，本试验过程中控制DRB1基因外显子1、3、

4、5和6基因序列不变，以保证能形成正确的高级构象。

国内用酿酒酵母构建绵羊MHCⅡ类多肽库的报道较少。DRB1基因编码的区域查理普斯歌曲 也

叫抗原肽结合区(peptidebindingsite，PBS)，在抗原递呈过程中发挥着重要的

作用，它的多态性与其功能直接相关，影响着动物对疾病的抵抗能力。因此，本试

验选用酿酒酵母展示技术，构建MHCⅡDRB1基因外显子2的多态酵母展示库，

通过布鲁氏南红玛瑙怎么鉴别 菌抗原肽和酵母展示库的相互作用，以期筛选出与布鲁氏菌病易感性相

关的抗原肽，为布鲁氏菌亚单位疫苗的研究提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

绵羊脾脏组织来源于新疆农八师紫泥泉种羊场；酿酒酵母EBY100、表面展示载体

pYD1均购自Invitrogen公司；pEASY-T1载体购自北京全式金生物技术有限公

司。

反转录试剂盒(TransScriptFirst-strandcDNASynthesisSuperMix)、胶回收

试剂盒、质粒提取试剂盒、TIANampBloodDNAKit均购自北京全式金生物技

术有限公司；限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、BglⅡ、SacⅠ及T4连接酶均购自

TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1总RNA提取及逆转录利用TRIzol试剂盒提取绵羊脾脏组织总RNA。根据

PrimeScriptFirst-strandcDNASynthesisSuperMix说明书进行逆转录合成

cDNA，-20℃保存备用。

1.2.2特异性引物设计参照GenBank上已发表的绵羊MHCⅡDRB1基因序列

(登录号：EU176819.1)，通过PrimerPremier5.0软件设计1对特异性引物，引

物序列为：上游引物F：5′-CG-GGATCCATGGTGTGCCTGTATTTCTCC-3′；下游

引物R：5′-CCGCTCGAGTCAGCTCAGGAGCCCTGTTGGC-3′(下划线处为

BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点)。引物由华大基因公司合成。

1.2.3绵羊DRB1基因的克隆PCR扩增体系20L：2TaqPCRMasterMix8

L，上、下游引物各1L，模板2L，ddH2O8L。PCR扩增条件：94℃预

变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃

延伸10mi清蒸扇贝 n。琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR扩增产物，与pEASY-T1载体连接，

转化大肠杆菌DH5感受态细胞，37℃过夜培养，选阳性单克隆，37℃培养10

h，菌液经PCR鉴定后，提取质粒命名为pEASY-T1-DRB1，双酶切鉴定，取4

个鉴定正确的重组菌送华大基因公司测序，利用SeqMan等软件对测序结果进行

比对分析。

1.2.4重组表达载体的构建及鉴定用BamHⅠ和XhoⅠ对重组质粒pEASY-T1-

DRB1和酵母表面展示载体pYD1进行双酶切，琼脂糖胶回收试剂盒回收目的片段

并纯化，得到的DRB1基因序列和酵母展示载体pYD1与T4DNA连接酶16℃

连接10h，转化大肠杆菌DH5感受态细胞，筛选阳性转化子，37℃过夜培养，

菌液经PCR鉴定后提取质粒pYD1-DRB1，双酶切鉴定，取4个鉴定正确的重组

菌送华大基因公司测序，利用SeqMan等软件对测序结果进行比对分析。

1.2.5重组质粒转化酵母细胞的鉴定按pYD1YeastDisplayVectorKit说明书，

将所提取的重组质粒pYD1-DRB1转化酿酒酵母感受态细胞，在选择培养基上筛

选阳性转化子，挑取单克隆，菌液PCR鉴定，命名为EBY100/pYD1-DRB1。

1.2.6点突变pEASY-T1-DRB1构建酵母展示库通过PrimerPremier5.0软件设

计2对特异性点突变引物B1F/B1R和S2F/S2R，引物序列为：B1F：5′-

GCCTGGGCCAGGAAGATCTAACCAC-ATTTC-3′，B1R：5′-

AGATCTTCCTGGCCCAGGCCAGGGGAGGGC-3′；S2F：5′-GCAGCGGCGA-

GTGGAGCTCATAGTGACTGT-3′,S2R：5′-

ATGAGCTCCACTCGCCGCTGCACAGTGAAA-3′。引物均由华大基因公司合成。

在pEASY-T1-DRB1外显子2两端进行碱基突变引入BglⅡ和SacⅠ，按Fast

MutagenesisSystem说明书构建出突变后的质粒pYD1-DRB1-TB，用BglⅡ和

SacⅠ进行双酶切鉴定，选取4个鉴定正确的重组质粒，送华大旅游英语单词 基因公司进行测序，

利用SeqMan等软件对测序结果进行比对分析，建库过程见图1。

1.2.7绵羊血液基因组DNA提取及检测参照TIANampBloodDNAKit提取绵

羊血液基因组DNA。盘分析法检测浓度，符合DNA纯度标准(15～30ng/L)的

样品用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。

1.2.8外显子2特异性引物设计根据突变后的序列，设计DRB1基因外显子2的

特异性引物MF和MR，预期扩增片段包含全部的外显子2序列。引物序列为：

MF：5′-GGAAGATCTAACCACATTTCCTGGAGTATACTAAGA-3′；MR：5′-

CGAGCTCCCACTCGCCGCTGCACAG-3′(下划线处为酶切位点BglⅡ和SacⅠ)。

引物由华大基因公司合成。

1.2.9DNA池化扩增外显子2将提取的500个绵羊基因组DNA以20个关闭防火墙命令 为一组，

等浓度混匀，以这25个混合液作为模板扩增。PCR扩增体系20L：DNA模板

3L，MF/MR各1L，2TaqPCRMasterMix8L，ddH2O7L。PCR扩

增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，

30个循环；72℃延伸8min。PCR产物经鉴定后送华大基因公司测序。

1.2.10重组突变质粒pYD1-DRB1-TB的酶切鉴定取BglⅡ和SacⅠ双酶切后的

pYD1-DRB1-TB和PCR产物，16℃水浴10h后转化大肠杆菌DH5感受态细

胞，涂布含Amp的平板后37℃过夜培养。用BglⅡ和SacⅠ双酶切重组质粒

pYD1-DRB1-TB，用1.0%琼脂糖凝胶电泳后紫外光下观察，拍照保存。

1.2.11酵母展示库容量及质量的鉴定取1L培养菌梯度稀释后，涂布Amp平

板，根据菌落推算。在选择性培养基上筛选阳性转化子，挑取单菌落接种于2%葡

萄糖的YNB-CAA培养基中，30℃振荡培养24h，使D600nm值在2～5之间，

用含2%半乳糖的YNB-CAA培养基重悬，20℃振荡培养24h，诱导目的蛋白表

达；通过细胞免疫荧光法在20倍荧光显微镜下检测，判断绵羊DRB1基因是否展

示在酵母细胞表面。

图1酵母表面展示库的构建示意Fig.1Theconstructionofyeastsurface

displaylibrary

2结果

2.1总RNA提取及绵羊DRB1基因PCR扩增

从绵羊脾脏组织中提取总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测显示，可观察到28S、

18S和5S3条条带，其中18S和28S条带明显清晰，而5S条带较弱，28S条带

的亮度约为18S条带亮度的2倍，说明RNA保持完整；RNA样品经

BioSpectrometer系列分光光度计测定，D260nm/D280nm值介于1.8～2.0

之间，说明RNA纯度较高。

以提取的总RNA为模板，逆转录及PCR扩增后，取10L扩增产物进行琼脂糖

凝胶电泳检测，观察到特异性目的条带，大小约818bp(图2)，包含完整的DRB1

基因序列。

M,DL2000DNAMarker；1～4,DRB1基因PCR扩增产物M,DL2000DNA

Marker；1-4,PCRproductsofDRB1gene图2DRB1基因PCR扩增结果Fig.2

PCRamplificationproductsofDRB1gene

2.2重组质粒pEASY-T1-DRB1的鉴定

pEASY-T1载体与胶回收产物连接，转化大肠杆菌DH5感受态细胞后，涂布于

含Amp的平板上筛选阳性重组子，挑取单克隆，37℃培养10h，提取质粒后进

行双酶切鉴定，结果表明，菌液PCR扩增获得的特异性条带与对重组载体用

BamHⅠ和XhoⅠ双酶切得到的基因片段大小一致，表明目的基因已连接到克隆

载体上，重组质粒命名为pEASY-T1-DRB1(图3)。对提取的重组质粒进行测序，

结果证实克隆片段确实为绵羊DRB1基因编码区序列。

MIV,DNAMarkerⅣ;M,DL2000DNAMarker;1～4,重组质粒pEASY-T1-DRB1

双酶切产物MIV,DNAMarkerⅣ;M,DL2000DNAMarker;1-4,Doubleenzyme

digestionproductsofrecombinantplasmidpEASY-T1-DRB1图3重组质粒

pEASY-T1-DRB1双酶切鉴定Fig.3Doubleenzymedigestionresultof

recombinantplasmidpEASY-T1-DRB1

2.3重组表面展示质粒pYD1-DRB1的鉴定

重组质粒pEASY-T1-DRB1和酵母表面展示载体pYD1以BamHⅠ和XhoⅠ双酶

切，胶回收纯化后的连接产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞，在含Amp的平

板上筛选阳性重组子，菌液经PCR鉴定，提取质粒进行双酶切鉴定，结果发现，

菌液PCR获得的特异性条带和双酶切得到的基因片段大小均为801bp(图4)，表

明目的基因重组到表面展示载体pYD1上，重组质粒命名为pYD1-DRB1。测序结

果证实克隆片段确实为绵羊DRB1基因编码区序列。

2.4突变后重组质粒pYD1-DRB1-TB的鉴定

突变后的重组质粒pYD1-DRB1-TB转化并筛选阳性重组子，提取质粒后用BglⅡ

和SacⅠ两种限制性内切酶进行双酶切鉴定，结果发现，菌液PCR获得的特异性

条带和双酶切得到的基因片段大小均为270bp(图5)，表明目的基因重组到表面

展示载体上，成功构建点突变后的表面展示重组质粒pYD1-DRB1-TB。

MIV,DNAMarkerⅣ；M,DL2000DNAMarker；1～3,重组质粒pYD1-DRB1

双酶切产物MIV,DNAMarkerⅣ;M,DL2000DNAMarker;1-3,Double

enzymedigestionproductsofrecombinantplasmidpYD1-DRB1图4重组

质粒pYD1-DRB1双酶切鉴定Fig.4Doubleenzymedigestionresultof

recombinantplasmidpYD1-DRB1

MIV,DNAMarkerⅣ；M,DL2000DNAMarker；1、2,重组质粒pYD1-DRB1-

TB双酶切产物MIV,DNAMarkerⅣ;M,DL2000DNAMarker;1and2,Double

enzymedigestionproductsofrecombinantplasmidpYD1-DRB1-TB图5重

组质粒pYD1-DRB1-TB双酶切鉴定Fig.5Doubleenzymedigestionresultof

recombinantplasmidpYD1-DRB1-TB

2.5库容检验

用重组质粒pYD1-DRB1-TB转化大肠杆菌DH5感受态细胞，取1L培养菌梯

度稀释后涂布Amp平板，根据菌落推算随机肽库的库容为105个以上，远远高

于理论库容量500个的多样性。

2.6酵母展示库的免疫荧光检测

取经半乳糖诱导后的酵母菌液，在荧光视野下观察到绿色荧光(图6)，表明DRB1

基因在酵母表面表达为具有正确高级结构的蛋白。

A，可见光；B，荧光A,Visiblelight;B,Fluorescentlight图6酵母表面展示库的

细胞免疫荧光图Fig.6Cellimmunfluorescenceofyeastsurfacedisplay

library

3讨论

MHC作为脊椎动物适应性免疫系统的一部分，在病原体识别中起着关键作用[20]。

淋巴细胞不能直接识别抗原，抗原被降解为抗原肽，加载到MHC分子上，才能被

淋巴细胞识别[21]。MHCⅠ类分子负责递呈内源性抗原，MHCⅡ类分子主要递呈

外源性抗原[22]。因此，MHC候选基因抗病能力和抗病育种已成为目前的研究热

点之一。MHCⅡ类分子的表达及其表达水平很大程度上决定了T细胞的功能。因

此，它在免疫学上有很大的研究价值。

绵羊MHCⅡDRB1基因外显子2基因是一个关键的基因，负责动物对寄生虫的抗

病性[23]。Koutsogiannouli等[24]采用PCR-SSCP结合测序的方法，对4个地

中海品种的绵羊进行研究，结果表明，绵羊DRB1外显子2(抗原肽结合区)具有较

高的多态性。Pouya等[25]采用PCR-SSCP和直接测序的方法对322只绵羊进行

研究，结果发现，绵羊DRB1基因外显子2有26个SNPs，其基因型与免疫学参

数和体重相关，可作为标记辅助选择的重要片段，特别是改善羊的免疫力。

Falorni等[26]研究发现，HLA-DRB1基因的多态性和自身免疫性艾迪生病显著相

关。Krogman等[27]研究发现，HLA-DRB1基因的多态性和血清中的细胞因子水

平相关。但关于DRB1基因酵母表面展示相关的报道较少，因此研究DRB1基因

的酵母表面展示及其多态酵母展示库的构建对布鲁氏菌亚单位疫苗的研制具有重要

的意义。

布鲁氏菌按照宿主特异性可分为羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌、绵

羊附睾种布鲁氏菌、沙林鼠种布鲁氏菌、犬种布鲁氏菌。近年来，有学者分别从鲸

鱼、海豚、鳍足类、田鼠、乳房移植患者的血液和伤口分泌液中分离出4个新的

布鲁氏菌种[28]。布鲁氏菌病遍布世界160多个国家，中国近年疫情发展迅速，

部分地区人畜布鲁氏病感染率呈线性增长趋势。因此，中国布鲁氏菌病的预防和控

制迫在眉睫。目前用于人布鲁氏菌病免疫的疫苗主要有两种：19-BA疫苗和

104M疫苗，用于动物布鲁氏菌病防控的主要为弱毒活疫苗，常见的有S19、M5、

RB51、S2和Rev.1等。但这些疫苗在安全性和有效性方面存在很大的问题。因此，

布鲁氏菌新型分子疫苗的探索和研制已刻不容缓。

本研究根据GenBank中公布的绵羊MHCⅡDRB1基因序列(登录号：

EU176819.1)，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，上、下游分别引

入BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，对其扩增序列进行克隆测序，发现其与绵羊

DRB1基因序列一致，对重组质粒和酵母表面展示载体pYD1进行双酶切，连接并

转化酵母细胞，挑取单克隆，菌液PCR鉴定得到清晰的目的条带，表明表面展示

重组质粒pYD1-DRB1构建成功；同时通过设计突变引物，在DRB1基因外显子

2的上游第9个碱基和下游第3个碱基处，分别引入BglⅡ和SacⅠ两个酶切位点，

构建重组质粒T1-DRB1-TB，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒T1-DRB1-TB

和表面展示载体pYD1，连接并测序，构建突变的酵母表面展示重组质粒pYD1-

DRB1-TB，DNA池化后扩增出外显子2，用BglⅡ和SacⅠ双酶切重组质粒

pYD1-DRB1-TB，切掉外显子2序列，替换其他的具有多态性的外显子2序列，

挑取阳性单克隆，菌液PCR鉴定得到清晰的条带，成功构建出绵羊DRB1基因的

多态酵母表面展示库；并对库容量进行鉴定；用2%半乳糖诱导酵母表面蛋白的表

达，进行细胞免疫荧光检测，荧光条件下，酵母细胞发出绿色荧光，说孔乙己是一个怎样的人 明MHCⅡ

DRB1蛋白在酵母细胞表面成功表达，且具有正确的高级结构，可通过该多态展示

库对布鲁氏菌抗原肽进行筛选。目前，关于MHC基因的研究大多集中在多态性

[29]、单倍型[30]方面，很少有MHC和布鲁氏菌抗原肽相互作用的报道，本研究

首次成功构建了绵羊MHCⅡDRB1全基因多态酵母展示库，其库容量达到后续试

验的要求(布鲁氏菌抗原肽和酵母展示肽库的互作)，可用于布鲁氏菌抗原肽的筛选，

为进一步研究布鲁氏菌抗原肽提供一定的理论基础。

4结论

本研究利用酵母表达质粒pYD1，通过设计特异性点突变引物及运用点突变试剂盒，

引入BglⅡ和SacⅠ两个酶切位点；构建DNA池，成功构建了绵羊白细胞表面抗

原DRB1全基因的酵母表面多态展示库；转入酵母细胞后，经2%半乳糖诱导，细

胞免疫荧光法间接标记目的蛋白，在免疫荧光显微镜下观察到目的蛋白表达，且其

具有正确的高级结构。

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