叶酸代谢

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MTHFRC677T,MTHFRA1298C,MTRRA66G基因检测操作流程

实验流程

一、操作步骤

适用仪器：普通PCR仪

样本要求：EDTA抗凝剂的静脉全血（100l），室温保存不超过7天，2～8℃保存不超过1个月，

-20℃保存不超过3个月，反复冻融次数不超过5次；DNA的浓度应不低于5ng/l，A260/A280

应在1.6~2.0之间。有血块的样本需经匀浆处理或用b站电影 组织研磨仪研磨处理后再进行全血DNA的提

取。

检验方法：（试剂盒中的检本测卡、阳性/阴性对照卡上标识解释如下：M表示突变型，WT表示野

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生型，C表示质控线，T表示检测线。）

A：样本DNA的制备

试剂盒准备工作：

1、清洗液BW-I：用50ml量筒分别移取35ml无水乙醇（分析纯）和35ml异丙醇加入至清洗

液BW-I试剂瓶中，颠倒混合均匀，在试剂瓶上标明“已加入醇”和日期，备用。

2、清洗液BW-II：用50ml量筒移取49ml无水乙醇加入至清洗液BW-II试剂瓶中，颠倒混合均

匀，在试剂瓶上标明“已加入醇”和日期，备用。

3、蛋白酶K准备：取出蛋白酶K，室温解冻，涡旋混匀后备用。

4、磁性微粒准备：将磁性微粒涡旋混匀，保证均一。

实验操作步骤：

1.将20l蛋白酶K溶液加入2ml离心管的管底。依次加入100l全血、200l裂解液

BL，用涡旋振荡器混合15c(以下简称涡旋混匀)，56℃水浴20min。

2.向步骤1裂解处理的样品中依次加入300l结合液BI、25l的磁性微粒（移取前必须充

分涡旋混匀），涡旋混匀，室温静置5min。磁性分离5min，弃上清。

3.从磁性分离器上取出离心管，加入400l清洗液BW-I，涡旋混匀，磁性分离至上清澄清（期

间上下颠倒数次，以清洗离心管管壁），弃上清；重复本步操作，以400l清洗液BW-I重复

清洗一次。

4.从磁性分离器上取出离心管，加入400l清洗液BW-II，涡旋混匀，磁性分离至上清澄清（期

间上下颠倒数次，以清洗离心管管壁），弃上清（尽可能弃去所有的清洗液BW-II）。

5.打开离心管盖，将其室温晾干5min。

6.从磁性分离器上取下离心管，向管中加入100l洗脱液ES，涡旋混匀，56℃水浴5min。

7.将离心管置于磁测量工 性分离器上，磁性分离至上清澄清。将上清液（分离纯化得到的DNA溶液）

转移到2ml离心管中，直接用于下游实验或于-20℃保存备用。

B：PCR扩增液准备

（1）每人份需做两个反应，取两个无菌0.2mlPCR薄壁管，在PCR薄壁管管盖上依次标有M、WT。

（2）将试剂从-20℃取出平衡至室温，瞬时离心。在标有M的管中加入29l扩增液（M），在标

有WT的管中加入29l扩增液（WT）。

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（3）分别向以上M和WT各管中加入1l反应液。将管盖花样面点 盖紧后，涡旋混匀，瞬时离心待用。

C：待检测DNA样本的配制

在上述标有M、WT管中分别加入3l待测基因组DNA，分别再加入17lddH2O使终体积为50l。

将管盖盖紧后，涡旋混匀，瞬时离心。

D：PCR扩增

将PCR管放入PCR仪中，按如下程序扩增：50℃2min；95℃5min；94℃30c、60℃30c、

65℃1min（26Cycles）；65℃10min；4℃Hold。取出PCR产物，2~8℃保存。

E：检测卡检测实验

从密封袋中取出检测卡，将待测样本M与WT管中的PCR产物分别滴加在检测卡对应的样品垫处，

待2~5min对结果进行判读，20min后结果不可靠。

F：质量控制

（1）检测结果中阳性对照应在阳性对照卡检测线（T线）出条带，阴性对照应在阴性对照卡检测

线（T线）不出条带。正常检测时，应定期进行阳性对照品及阴性对照品实验。

（2）阳性对照品实验：取两个无菌0.2mlPCR薄壁管，在PCR薄壁管管盖上依次标有M、WT，将

20lM阳性对照液、20lWT阳性对照液分别加入标学习历史 有M、WT的PCR薄壁管中，再依次分别加入

M扩增液29l及1l反应液、WT扩增液29l及1l反应液，按照步骤中D~F完成，检测线（T

线）及质控线（C线）均应出现条带。

（3）阴性对照品实验：取两个无菌0.2mlPCR薄壁管，在PCR薄壁管管盖上依次标有M、WT，将

M扩增液29l、1l反应液及WT扩增液29l、1l反应液分别加入标有M、WT的PCR薄壁管中，

再分别加入20l阴性对照液，按照步骤中D~F完成，质控线（C线）应出现条带，检测线（T线）

应无条带出现。

G：结果判读（如下图、下表）

如上图一所示，以阳性对照液为模板进行PCR反应，对PCR产物进行检测，检测线（T线）有条

带出现，作为阳性对照；以阴性对照液为模板进行PCR反应，对PCR产物进行检测，检测线（T

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线）无条带出现，为阴性对照。若阴性样本有条带出现，有可能加样时未及时更换吸头，有DNA

污染，建议在操作过程中，先配制阴性对照管并及时闭合PCR管盖。图二显示MTHFR677CC表示

正常野生型；图三显示MTHFR677TT表示一对等位基因的第677位胞嘧啶（C）均变为胸腺嘧啶（T），

即纯合突变；图四显示MTHFR677CT表示其中一个等位基因的第677位胞嘧啶（C）变为胸腺嘧啶

（T单项选择 ），即杂合突变；图五质控线（C线）无条带或质控线（C线）与检测线（T线）均无条带，即

为无效检测。无效原因可能为操作不正确或试纸条已变质损坏。应再次仔细阅读说明书，并用新

的检测卡重新检测。如果问题仍然存在，应立即停止使用该批号产品，并与厂家或供应商联系。

H：注意事项

（1）实验室应该遵循PCR实验规范的要求分区操作，各区物品均为专用，不得交叉使布鲁将军 用，加模板和引物

的移液器不能混用，每次加样后均需更换吸头，推荐使用无核酶、带滤芯的吸头。各区的仪器、设备和工

作服应独立使用。

（2）本试剂盒用于体外操作。用户切勿吸入试剂或直接接触皮肤。

（3）使用本试剂盒前，请仔细阅读说明书，严格按照说明书的要求操作。打开包装后请尽快使用。

（4）使用本试剂盒时，因PCR体系为50l体系，应使用200l的PCR扩增管进行操作。

（5）本试剂盒备有“PCR组分加入确认单”，在【检测方法】中的步骤B(PCR扩增系统的准备)和C(待检

测DNA样本的配制)操作过程中应在确认单中逐一标注，以保证“扩增液、反应液、DNA模板和ddH2O”已

准确无误加入至PCR扩增管里。

（6）如发现铝箔袋包装破损，请勿使用；铝箔袋包装内的干燥剂，请勿使用。

（7）试剂使用前，请将反应液、扩增液等瞬时离心。

图二野生型

图三纯合突变

图一阳性及阴性对照

图五无效图

图四杂合突变

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