显微鉴别

更新时间:2023-03-26 15:28:21 阅读: 评论:0

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显微鉴别
2023年3月26日发(作者:去澳大利亚旅游)

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标准操作规程

标题:中药材及其制剂显微鉴定法

生效日期年月日页次:1/10

编号:SOP-QC-058-01颁发部门:质量管理部

新订□修订□

原文件号:

编制:部门审核:QA审核:批准:

分发部门:QC。

目的:建立中药材及制剂显微鉴定方法操作规程。

范围:所有购进的中药材及正式生产的含原药粉的制剂品种。

责任者:QC主任、检验员对本SOP的实施负责。

规程:

1.药材及成方制剂显微鉴定法是应用动植物细胞、组织和矿物晶体光学

等知识鉴别中药材或中成药的一种方法。通常是借助显微镜进行观察,故称

“显微鉴别法”主要适用于:

1.1.药材性状鉴别特征不明显或外形相似而组织构造不同;

1.2.药材破碎不易辨别或区分;

1.3.药材呈粉末状态或为成方制剂;

1.4.用显微方法确定药材中有效成份在组织中的分布状况及其特征。

2.显微标本片的分类

2.1.临时性制片操作简单,制作方便,主要用于药材检验。

2.1.1.切制片采用滑走切片或徒手切片法制片。适用于植物根、茎类

药材的鉴别。

2.1.2.表面片采用剪、撕等方法制片。适用于叶类、花类及全草类药

材的叶片、花冠、萼片、苞片等的鉴别。

2.1.3.解离组织片用适当的组织解离液使组织细胞相互适度解离后

装片,适用于观察比较坚硬的细胞组织,如导管、纤维、石细胞等的形态。

2.1.4.磨制片适用于矿物药或有些坚硬的动物类药材如珍珠、石决明

及动物骨骼的鉴别。

2.1.5.粉末片适用于花粉粒、孢子等的形态特征或构造观察。

2.2.石蜡片亦称永久片制成的石蜡切片外形较完整,厚薄均匀,且可制

得连续切片,观察方便,能长期保存。适用于药材鉴定研究工作。以上各临

时装片均可按规定和制备方法制成永久性的石蜡切片。

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3.仪器和用具

3.1.仪器生物光学显微镜、镜台测微尺、离心机。

3.2.用具

3.2.1.放大镜、刀片、解剖刀、镊子、剪、解剖针。

3.2.2.载玻片、盖玻片。

3.2.3.吸湿器、培养皿或小烧杯、酒精灯、铁三角架、石棉网、滴瓶、

试管、试管架、滴管、玻璃棒、乳钵、量筒等。

3.2.4.毛笔、铅笔、带盖搪瓷盘、纱布、吸水纸、火柴等。

4.试液及配制

4.1.水合氯醛试液取水合氯醛50g,加水15ml与甘油10ml使溶解,

即得。此液为透化剂,可使干缩的细胞壁膨胀而透明,并能溶解淀粉粒、树

脂、蛋白质及挥发油。

4.2.甘油醋酸试液(斯氏液)取甘油、50%醋酸与水各等份,混合即得。

此液专用于观察淀粉粒形态,可使淀粉粒不膨胀变形,便于测量其大小。

4.3.甘油-乙醇液取甘油1份,50%乙醇1份,混合即得。

此液为封藏液,用于保存植物配料及临时切片,有软化组织的作用。

4.4.苏丹Ⅲ试液取苏丹Ⅲ0.01g,加90%乙醇5ml溶解后,加甘油5ml

摇匀即得。本液应置棕色玻璃瓶内保存,在2个月内应用。

4.5.钌红试液取10%醋酸钠溶液1-2ml,加钌红适量使呈酒红色即得,

本液应临用时新配。

4.6.间苯三酚试液取间苯三酚1g,加90%乙醇100ml,使溶解,滤过

即得。应置棕色玻璃瓶内,在暗处保存。此液与浓盐酸合用,可使木化细胞

染成红色或紫红色。

4.7.碘试液取碘化钾0.5g,溶于少量水中,加碘1g,使溶解加水至

100ml即得。

4.8.硝酸铬试液取硝酸铬10ml,加入100ml水中,混匀。另取铬酸10g,

加水100ml使溶解。用时二液等份混合,即得。此液为常用的“植物组织解

离液”。检品的解离浸泡时间,依材料的质地不同而异。

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4.9.-萘酚试液取15%的-萘酚乙醇溶液10.5ml,缓缓加入硫酸

6.5ml,混匀后再加乙醇40.5ml及水4ml,混匀即得。

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4.10.硝酸汞试液(米隆氏试液)取汞4.5g,加发烟硝酸3ml,待作用

完毕,加等量水稀释即得。本液应置棕色玻璃塞瓶内,在暗处保存。用于检

查糊粉粒,染成砖红色。

4.11.氯化锌碘试液取碘化钾8g,加入8.5ml水使溶解,再加无水氯

化锌2.5g使溶解,加碘适量至饱和,即得。本液应置棕色玻璃瓶塞内。用于

检查木质化与纤维素细胞壁,前者显黄棕色,后者显蓝色或紫色。

5.显微标本片的制做

5.1.切片(横片或纵片)

5.1.1.药材的预处理先将药材表面泥沙刷洗干净,将应观察的部位,

切成大小适当的块或段,一般以宽1cm,长3cm为宜,厚10~20m,切面削

平整。质地软硬适中的药材可直接进行切片。质地坚硬的则须先使其软化后

再切片。软化方法可放在吸湿器(即干燥器底部盛蒸馏水并滴数滴苯酚防霉,

上部瓷板上置药材样品吸湿)中闷润,或在水中浸软。有些根、根茎、茎及

木类药材,质地虽坚实,可将削平的切面浸水中片刻,表面润湿时取出,直

接切片也能切成较完整的薄片。过于柔软的材料,可将其浸入70%-95%乙

醇中,约20min后可变硬些,即可进行切片。对于细小、柔软而薄的药材,

如种子或叶片,不能直接手持切片,种子类可置软木中塞或橡胶片中(一侧

切一窄缝,将种子嵌入其中绿色环保的内容 ),叶类药材可用质地松软的通草或向日葵的茎髓

作夹持物进行切片。药材在预处理时应注意不能影响要观察的显微鉴别特征。

5.1.2.徒手切片具有操作简便、迅速,方便,制成片能保持其内含物

的固有特征,便于进行各种显微化学反应观察的特点,是显微鉴别中最为常

用的方法。

5.1.2.1.切片右手持刀片,左手拇指和食指关节夹持药材,中指托着

药材的底部,使药材略高出食拇二指,肘关节应固定,使材料的切面保持水

平,刀口向内并使刀刃自左前方向右后方切削,即可切得薄片。操作时,材

料的切面须经常加水或50%乙醇保持湿润,防止切片粘在刀片上。切好的切

片用毛笔蘸水轻轻从刀片上推入盛有水或50%乙醇的培养皿中。

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5.1.2.2.徒手圆筒生物切片器切片将药材用通草或软木夹持,固定于切片

器持物筒中;具有一定硬度的药材可直接固定于持物筒中;左手持切片器,

拇指与小拇指持底盘的边缘,食指端顶动中柱上的固定螺帽,使切片整体方

向不变,以保持材料的切片方向固定;右手持刀片,刀柄靠于拇指与食指部,

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食指与中指轻压于刀片的上面,刀片平贴于刀片器圆台上,由左上方至

右下方迅速滑动,切下的切片用毛笔沾水取下置盛水的培养皿中。

5.1.2.3.装片选取薄而平整的切片置载玻片上,根据所要观察的内容

要求,滴加适宜的试液1~2滴,盖好盖玻片,即可在显微镜下观察。如加水

合氯醛试液透化,将切片移载玻片上滴加1~2滴水合氯醛试液,在酒精灯上

微微加热,至边缘起小泡即停止加热,继续补充试液再加热,以不烧干为度,

直至透化完全为止;加热温度不能过高,以防水合氯醛试液沸腾,使组织内

带入气战狼2百度网盘 泡,加热时应将载玻片不断移动,不宜对准一处烧,以免受热不匀而

炸裂,透化后放冷,加甘油乙醇试液1~2滴后加封盖片,贴上标签,冬日室

温较低时,透化后不待放冷即加甘油乙醇试液,以防水合氯醛试液结晶析出

而防碍观察。水合氯醛试液有洁净作用,并能使已收缩的细胞膨胀,能清楚

观察组织构造,可溶解淀粉粒、蛋白质、叶绿素、挥发油、树脂等,对草酸

钙结晶无作用,为观察草酸钙结晶的良好试剂。如需观察菊糖等一些多糖物

质则加水合氯醛试液不加热。

5.1.3.滑走切片机切片此法不需要较高的技巧,只要了解掌握操作方

法,短期内即可学会并切出较薄的切片,适用于质地坚实、形状较大的药材

切片。柔软的材料经冷冻处理后便可切得较薄的的切片。

5.1.3.1.材料制备经软化处理的材料,检查软化是否合适,可用刀片

切割材料,若较容易切下薄片,则软化适宜。柔软的药材可直接用胡萝卜或

土豆作夹持物。新鲜材料则直接浸入石蜡中,使材料外面包上一层石蜡。

5.1.3.2.切片机调试及材料安装切片前,先安装好要片机使稳固,进

行调试检查。将切片刀夹持在夹刀器上夹紧,调整刀的角度(约00~150);

调整厚度调节器至所需厚度。把制备好的材料用两块软木塞夹住或直接放在

切片机的材料固定器上夹正,使材料露出软木塞或固定器上端约0.5cm,调

整好材料高报答作文 度,使刀机刀刃靠近材料的切面,使材料切面与刀刃平等并略高

于刀刃约0.5~1mm。

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5.1.3.3.切片用右手所握夹刀器柄。往操作者方向迅速拉动,便切下

切片,且附着于刀的表面上,用毛笔蘸水把切片取下放入盛水的培养皿中。

将刀推回原处,转动厚度推进器,用毛笔蘸水润湿材料切面及刀刃,再拉切

片刀,往返推动,可得到许多厚度均匀完整的切片。若切片不成功,应检查

切片刀是否太钝,则应磨刀或换锋锐的切片刀,若切得太薄而破碎,则逐渐

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加厚度至切得完整的薄片为度。注意:夹持在材料固定器上的材料切面接近

于固定上端时,必须注意防止切片刀刃碰撞固定器而损毁切片刀。

5.1.3.4.装片为防止切片弯曲,可选取理想的切片,用两张载玻片夹

住,浸于水中4小时使材料压平,放入95%乙醇中固定,甘油装片观察。

5.2.粉末标本片的制做主要用于粉末状的药材及药材粉末制成的成方

制剂观察。

5.2.1.粉末制备药材要先干燥,磨或挫成细粉,装瓶,贴上标签。粉

末制备时,注意取样的代表性和全面性,如根要切取根头、根中及根尾等部

位,必须全部磨成粉,不得丢弃渣头。并需过4号筛,混合均匀。干燥时,

一般不能超过60℃,避免经受高温,使淀粉粒糊化,难以观察其完整者。

5.2.2.制片法用解剖针挑取粉末少许,置载玻片的中央位置,加适宜

的试液1滴,用针搅匀(如为酸或碱时应用细玻璃棒代替针),待液体渗入粉

末时,用左手食指与拇夹持盖片的边缘,使其与左侧药液层接触,再用右手

持小镊子或解剖刀托住盖玻片的右侧,轻轻下放,则液体逐渐扩延充满盖玻

片下方,如液体未充满盖玻片,应从空隙相对边缘滴加液体,以防产生气泡;

若液体过多,用滤纸吸去溢出的液体,最后在载玻片的左端贴上标签或做上

标记。

5.2.3.中药成方制剂的鉴别

5.2.3.1.散剂、胶囊剂,可直接取粉末装片或透化装片;

5.2.3.2.片剂,可取2~3片研细后,取粉末适量装片或透化装片;

5.2.3.3.水丸剂,可取数粒丸置乳钵中(若系包衣水丸,可刮去包衣)

研细,取粉末适量装片,或取粉末适量置小容器内,加水合氯醛试液透化(加

适量甘油以防水合氯醛结晶析出),搅匀,用吸管吸取混悬液装片。

5.2.3.4.蜜丸剂样品可用二种方法处理

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(1)用解剖刀沿蜜丸正中切开,从切面由外至内刮取少许样品,置载

玻璃片中央偏右,滴加适宜的试液,用玻璃棒搅匀。按上述粉末制片法制片,

或透化装片。

(2)将样品切碎放入容器,加水搅拌洗涤,然后置离心管中离心沉淀,

如此反复以除尽蜂蜜后,取沉淀或透化后装片。

5.2.3.5.含挥发油性成分的制剂,取其粉末进行微量升华装片。

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5.2.4.粉末制片的注意事项

5.2.4.1.粉末加液体搅拌及加盖处理时容易产生气泡。如用水或甘油装

片时,可先加少量乙醇使其润湿,可避免或减少气泡的形成,或反复将盖片

沿一侧轻抬,可使多数气泡逸出。搅拌时产生的气泡可随时用针将其移出。

5.2.4.2.装片用的液体如易挥发,应装片后立即观察,用水装片也较易

蒸发而干涸,通常滴加少许甘油可延长保存时间。

5.2.4.3需用水合氯醛试液透化时,应注意掌握操作方法,装片后用手

执其一端,保持水平置小火焰上约1~2cm处加热,并缓缓左右移动使之微沸,

见气泡逸出时离开火焰,待气泡停止逸出,再放在小火上,并随时补充蒸发

的试液,如此反复操作,直至粉末呈透明为止,放凉后滴加甘油镜检。

5.2.4.4.粉末药材制片时,每片取用量宜少不宜多,为使观察方便,可

多做些制片。如取量多,显微特征单一轮廓不清,反而费时,不易得出准确

结论。中药制剂的粉末检查,因在多味药材粉末中寻找某一味药材某一显微

特征,有时较难查见,可以取粉末量多些,置试管或小烧杯中,加入水合氯

醛试液,加热透化。透化好后再用吸管吸出,滴在载玻片上,加盖玻片,即

可观察。

5.3.表面标本片的制做主要用于叶类、花类(萼片、花瓣)、果实、草

质茎及鳞茎等药材的表面特征如毛茸、气孔、表皮细胞等的观察。质地菲薄

的药材可以整体装片;较厚的药材则须撕下表皮然后装片。

5.3.1.整体装片适用于较薄的叶类、萼片和花瓣。剪取欲观察部位约

4mm2的两小片,一反一正放在载玻片上,加水合氯醛试液,加热透化至透明

为至,盖好盖玻片即得。

另法,剪取欲观察薄片8mm2,置试管中加水合氯醛试液,加热透化,然

后移至载玻片上,切成相等两部分,将其中一片反过来,与另一片并列,再

加1~2滴封藏液,盖好玻片即得。

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5.3.2.表面撕离装片凡较厚的或新鲜药材,用上法不能使之透化或不

便于整体装片。将软化了的或新鲜材料固定住,然后用镊子夹住要剥取撕离

的部分,小心的撕离,或用解剖刀轻轻割(刮)去不需要的各层组织,只保

留表面层(上层或下层),将欲观察的表皮表面朝上,置载玻片上,加透化剂

透化后,放冷,加稀甘油1滴,贴上标签,即得。

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5.4.解离组织片制做适用厚壁组织或输导组织的单个细胞的显微观

察。将样品切成段(长约5mm,宽约2mm)或片(厚约1mm),对于木类或茎

类木质,最好切成纵长的小段,然后根据细胞壁的性质,按照下列方法之一

进行处理;如样品坚硬,木化组织较多或集成较大群束,可用硝铬酸法或氯

酸钾法;对于薄壁组织占大部分,木化组织少或分散存在的样品,可用氢氧

化钾法。

5.4.1.氢氧化钾法置样品于试管中,加5%氢氧化钾溶液2~3ml,加热

至用玻璃棒挤压能离散为止,倾去碱液,用水洗涤后,取出少量,置载玻片

上,用解剖针撕开,以稀甘油装片观察。

5.4.2.硝铬法置样品于小杯中,加20%硝酸与20%铬酸的等量混合液

适量,浸没样品,旋转约30~60分钟,坚硬的样品需时要长些,也可在水浴

上微温,至用玻璃棒挤压能离散为止,倾去酸液,用水洗涤后,取出少量,

置载玻片上,用解剖针撕开,以稀甘油装片观察。

5.4.3.氯酸钾法置样品于试管中,加硝酸溶液(1~2ml)及氯酸钾少量,

缓缓加热,待产生的气饱和时,再及时加入氯酸钾少量,以维持气泡稳定地

发生,至用玻璃棒挤压能离散为止。倾去酸液,用水洗涤后,撕开,封藏。

5.4.4.注意事项用氯酸钾法制片时,每次加入的氯酸钾不可过多,加

热温度不宜过高,否则突沸容易使液体逸出管外。加热时间长短因样品的硬

度和木化程度而异,通常约需5~15分钟。操作过程中产生的氯气有毒,应注

意通风。

用硝铬酸法解离也可在载玻片上进行。即取一块厚度适当的切片,置载

玻片上,滴加氯硝铬酸液使之浸没,放置约20分钟,轻轻压下或移动盖片使

之分离,其余操作同前,此法解离的细胞,可以看清其分离的组织部位。

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5.5.花粉粒与孢怎样去胃火除口臭 子片制做取花粉、花药(或小的花)或孢子囊群(干

燥样品浸于冰醋酸中软化),用玻璃棒捣碎,纱布过滤,滤液置离心试管中,

离心,取沉淀加新配制的醋酐与硫酸(9:1)的混合液1~3ml,置水浴上加热

2~3分钟,离心,取沉淀,用水洗涤2次,加50%甘油与1%苯酚3~4滴,

用品红甘油胶封藏观察。也可直接用水合氯醛试液装片,具体操作同粉末标

本片。

5.6.磨片凡需要观察断面,以一般切片法无法制做的标本,如坚硬的

动物药材珍珠、石决明、动物骨骼、矿物药材等可采用磨片法。片的厚度一

般为20~50m。磨片方法有手工磨制与机器磨制。

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5.6.1手工磨片选取合适的材料,一般以1~2mm为度,先置粗磨石(或

磨砂玻璃)上,加适量水,用食指、中指夹住材料,在磨石上往返研磨,待

两面磨均匀,厚度约数百m后,改用软木塞压在上面,再在细磨石上加水

磨,磨至透明时(20~50m),用水冲洗,再用95%乙醇封藏。

5.6.2.机器磨制地质矿产部门有专门人员机构与设备制做。

6.显微测量

显微鉴定时应用测量方法以细胞内含物等的大小,应用最多的是长度测

量,常用的是目镜测微尺与载物台测微尺。

6.1.目镜测微尺又称目镜量尺或目镜尺。它是在目镜内的一种标尺,

是一个直径18~20mm圆形玻璃片,中央刻有精确等距的平行线刻度鱼胶的功效及正确吃法 ,常为50

或100条。

目镜测微尺是用以直接测量物体的,但其刻度所代表的长度是根据显微

镜放大倍数不同而改变,故使用前必须用载物台测微尺来标化。

6.2.载物台测微尺又称镜台测微尺或台微尺。它是一种特制的载玻片,

中央粘有一小圆形玻片,上刻有将1mm(或2mm)精确等分为100(或200)

小格的细线,每一小格长为10m,它是用以标化目镜测微尺的。

6.3目镜测微尺的标化以确定使用同一显微镜及特定的物镜、目镜和镜

简长度时,目镜测微尺上每一格所代表的实际长度。

标化方法将载物台测微尺置于显微镜台上,按常齐桓晋文之事 规对光调焦,并移动测

微尺象于视野中央;从镜简中取下目镜,旋下接目镜的镜盖,将目镜测微尺

放入目镜简中部的光栏上(应正面向上)旋上目镜盖后返置镜简上,此时在

视野中,除镜台测微尺的象外,还同时可观察到目镜测微尺的分度小格,移

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动镜台测微尺和旋转目镜,使两种量尺的刻度平行。左边的

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“0”刻度重合,寻找第二条重合刻度。记录两刻度的读数,并根据比值

计算出目镜测微尺每小格在该物镜条件下所相当的长度(m)。例如:接目

镜头为10,接物镜为40时,目镜测微尺每17小格相当于载物台测微尺

4小格,则目镜测微尺每小格的长度为410m17=2.35m。

6.4.测定细胞及细胞内容物的方法

将载物台测微尺取下,换以装有待测的标本片。对光、调焦,移动载片,

使需测量的目的物置于目镜测微尺范围内,调清物象,计数出目的物占测微

尺的小格数,乘以目镜测微尺每一小格的长度值即得。

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计算公式:

尺的格数所测物体占有目镜测微

尺重合时所占的格数目镜测微尺与镜台测微

)尺重合时所具的长度(镜台测微尺与目镜测微

)待测物长度(

m

m

例如:测得淀粉粒长20小格,每小格长2.35m,202.35m=47m

6.5.注意事项

6.5.1.测量通常是在高倍镜下进行,因目镜量尺的每一小格的长度较

大,结果较为准确。但如测量较长的物体如纤维、非腺毛等时,则在低倍镜

下较为方便。

6.5.2.每次测量记录下数据,并分析数据最小值、最大值和多见值(

m)。如浙贝母淀粉粒直系为6~56m,表示最小值和最大值;如为6~40~56

m,中间的数值表示多见值。测量直径时,应以物体中部为准。

6.5.3.目镜测微尺所代表的长度随不同目镜与物镜配合而异,因此在检

验时,应将专用的目镜测微尺,在所用显微镜不同倍数的目镜与物镜组合后

进行测量其长度值,全部测量后记载于检验记录或将数值贴在显微镜镜座上,

备用。

6.5.4.测量时,如有大小与规定有差异时,允许有少数略高于或略低于

规定的数值。

7.显微鉴别法注意事项

7.1.粉碎用具用毕后,必须清理干净,干燥后才能使用于另一药材。

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7.2.所用盖玻片和载片应绝对干净。新片要用洗液浸泡或用肥皂水煮半

小时,用清水冲洗,再用蒸馏水冲洗1~2次,置于70~90%乙醇中,取出,

烘干。

7.3.进行显微鉴别时应有一定的步骤,一般先进行甘油醋酸片的观察,

后进行水合氯醛片观察,最后再进行滴加度剂或结合理化试剂的显微观察。

所以在检验中,首先观察淀粉粒,不论其大小和多少,首先描述,其次是其

它的显微特征。

7.4.为提高显微鉴别的正确性,可与对照药材或已知顺利实现品种的药

材对照观察。

7.5.成方制剂鉴别前,应了解处方组成,分析处方中各药材的主要鉴别

特征及其量的多少,进行显微观察时,至少要观察5片以上,使特征不致遗

漏。

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8.记录与报告

记录要求详细、清晰、明确、真实.

8.1.组织特征的记录,应从外至内的次序进行,对有鉴别意义的特征需

详细描述;并要绘制简图。有条件时可进行显微照相。

8.2.粉末显微鉴别时,先记录原粉末的色泽、气味。然后边观察边记录。

注意观察的全面性。观察每一张片,应自左上至右下,呈“之”字形扫描,

逐渐移动粉末片,全面观察应找的特征,将每一个特征一一描述及绘图,在

观察与描绘时,即应测量其长度,分析统计其长度(最大值、多见值、少见

值)。

描述特征时,应根据先多后少的顺序,将多见、易见的特征先加以描述,

顺次而为少见的,最后方描述偶见的,并在特征项下加注“多见”、“少见”

字样。描述先着重特殊的组织、细胞和内含物。对各类药材均具有的一些基

本组织,如叶类药材有栅栏细胞、海绵细胞、细小导管等可不作重点描述。

8.3.绘图时,应注意特征明确、边缘清晰。绘图方法有徒手或采用显微

描绘仪。徒手绘图时,一边用左眼向显微镜内观察,一边睁开右眼将视野中

特征图像用铅笔(HB铅笔画粗线、4H画中线、6H画细线)转绘于记录纸上。

如采用显微描绘仪或显微摄影,可根据各仪器的操作要求进行,并要注明放

大倍数,或加比例尺。

可编辑

精品

9.结论:根据检验的显微特征记录与标准记载或对照药材比较是否相

符,断定其是真假优劣。

.

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