赵文婷

２９４ 生 物 技 术

Ｈ

通 讯ｖ

．２４Ｎ。．２ Ｍａｒ．，ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣ ＮＯＬＯＧＹ ｏＩ Ｍａｒ ２０ｌ一５ Ｈ Ｖ ・— ｑ ｏ・ｚ ｚｕｌ

ｄｏｉ：１０．３９６９６．ｉｓｓｎ．１００９—０００２．２０１３．０２．０３５

植物瞬时表达技术的主要方法与应用进展

综 述

赵文婷 ，魏建和 ，刘晓东。，高志晖

１．东北林业大学园林学院，黑龙江哈尔滨１５００４０；２．中国医学科学院药用植物研究所，北京１００１９３

［摘要］ 瞬时表达技术是一种获得目的基因短暂的高水平表达的技术。与稳定表达相比，瞬时表达所需时间短，但

因未将外源基因整合到宿主植物染色体中，不能稳定遗传给下一代。我们简要综述了植物瞬时表达技术的各种方

法，介绍了各方法的原理、技术流程、影响因素及其应用。关于其应用，主要分析了生物制剂的合成、转录元件和转录

因子的克隆与分析、基因沉默、亚细胞定位、蛋白互作分析、抑制子功能鉴定、选择性剪接调控、植物品种的改良和选

育等方面。

［关键词】 瞬时表达；基因枪；农杆菌；聚乙二醇；植物病毒载体

［中图分类号］Ｑ９４３ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］ １００９—０００２（２０１３）０２—０２９４—０７

Ａｄｖａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｍａｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ

Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ

ＺＨＡＯ Ｗｅｎ－Ｔｉｎｇ ２，ＷＥＩ Ｊｉａｎ—Ｈｅ２，ＬＩＵ Ｘｉａｏ—Ｄｏｎｇ ，ＧＡＯ Ｚｈｉ—Ｈｕｉ

１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５００４０；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｌａｎｔ

Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｌｉａｎｗａｂｅｉ Ｒｏａｄ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３；Ｃｈｉｎａ

Ｃｏ－ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒｓ，ＬＩＵ Ｘｉａｏ－Ｄｏｎｇ，Ｅ－ｍａｉｈ ｌｉｕ１９６３１６＠１６３．ｃｏｒｎ；ＧＡＯ Ｚｈｉ－Ｈｕｉ，Ｅ－ｍａｉｈ ｚｈｇａｏ＠ｉｍｐｌａｄ．ａｃ．ｃｎ

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｉｎ ａ ｓｈｏｒｔ ｔｉｍｅ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ

ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｓｐｅｅｄｙ．Ｏｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｈａｎｄ，ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｄｏｅｓｎ ｔ ｉｎｔｅｇｒａｔｅ ｉｎｔｏ ｔｈｅ

ｈｏｓｔ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，Ｓ０ ｉｔ ｗｏｎ＇ｔ ｂｅ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ．Ｗｅ ｂｒｉｅｆｌｙ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅｉｒ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｗｉｄｅｌｙ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍａｎｙ ｐｌａｎｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ｃｌｏｎｅ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ—

ｔｉｏｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ，ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｅ，ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃ—

ｔｉｏｎ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ，ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ

ａｎｄ ｂｒｅｅｄｉｎｇ，ｅｔｃ．

［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｇｅｎｅ ｇｕｎ；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ；ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ；ｐｌａｎｔ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ

瞬时表达技术是在相对短的时间内将目标基因

转入靶细胞，在细胞内建立暂时高效的表达系统，获

得该目的基因短暂的高水平表达的技术。与稳定表

达相比，瞬时表达所需时间短，不需要将外源基因整

合到宿主植物染色体中，比较适用于基因一蛋白的一

些细胞生物学研究。瞬时表达近年来在国内外已被

应用于多种植物的研究和应用开发，从农作物的小

麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）、玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、水稻

（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ） Ｊ，到园艺观赏植物的矮牵牛（Ｐｅｒｕ．

ｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）、长春花（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）、香蒲

（Ｔｙｐｈａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）等 以及藻类植物绿藻（Ｃｈｌｏ．

ｒｏｐｈｙｔａ） 等都已建立了相应的瞬时表达体系，为其

收稿日期：２０１２—０９—２１

基金项目：国家自然科学基金（８１００１６０７）

作者简介：赵文婷（１９８７一），女，硕士研究生

通信作者：刘晓东，（Ｅ—ｍａｉｌ）ｌｉｕ１９６３１６＠１６３．ｃｏｎ；高志晖，（Ｅ—ｍａｉｌ）

ｚｈｇａｏ＠ｉｍｐｌａｄ．ａｃ．ｃｎ

基因功能研究和利用提供了便利。

１ 植物瞬时表达技术的方法

植物瞬时表达技术导入目标外源基因的方法与

稳定表达技术类似，使用较多的有基因枪法ｕ 、农杆

菌渗透法 ”、聚乙二醇（ＰＥＧ）法 １、电击法 及植物

病毒载体介导的方法 。

１．１基因枪介导的方法

基因枪法介导的瞬时表达应用较早，技术也较

成熟。其原理是利用高速飞行的微米或亚微米级惰

性粒子（钨或金粉），将包被其外的目的基因直接导

人受体细胞，并释放出外源ＤＮＡ，使ＤＮＡ在受体细

胞中获得短暂的高水平表达，从而实现对受体细胞

的瞬时转化。基因枪法的主要技术流程包括载体构

建、金粉或钨粉包裹质粒、基因枪轰击和瞬时表达。

赵文婷等：植物瞬时表达技术的主要方法与应用进展 ２９５

植物材料的种类 、材料的状态、氦气压力、轰击次

数 驯等因素对瞬时表达效率均有影响。基因枪转

化法不受材料基因型的限制，但只能靶向植物组织

表面的细胞，获得并表达外源基因的细胞数目比较

少，一般为点状分布，瞬时表达效率较低。

１．２农杆菌介导的方法

农杆菌介导的瞬时表达是一种快速有效的分析

基因表达的方法 “。其原理是将目的基因插入载

体，转化到根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｏｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）

中，真空渗透或注射等方法使农杆菌与植物材料细

胞接触，从而大部分的Ｔ～ＤＮＡ进入细胞核内进行瞬

时表达，几天后即可检测到外源基因的表达。农杆

菌渗入法的技术流程包括载体构建、农杆菌培养、针

管注射浸润和瞬时表达。影响农杆菌瞬时表达系统

的因素主要有农杆菌菌株、浓度、生长环境，及植株

的基因型和叶片的生理状况等。多种植物的组织都

可以用于农杆菌转化，如悬浮细胞、愈伤组织、子叶、

叶片 、茎或正在发芽的种子。实验中许多因素都

会影响转化效率，包括转化材料的状态，农杆菌菌株

的类型『２ 、浓度 ，农杆菌与植物材料共培养时间 、

温度口 及光照等。一些物理方法也可以提高瞬时表

达的效率 。农杆菌介导的瞬时表达已在许多植物

组织中取得了成功，如拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）

的叶片，百合（Ｌｉｌｉｕｍ￣ｆｏｒｍｏｌｏｎｇｉ） 、金鱼草（Ａｎｔｉｒｒｈｉ—

ｎＵｌＴ￣ｍ口 ）的花瓣，半夏（Ｐｉｎｅｌｌｉａ Ｔｕｂｅｒ）无菌叶片、

叶柄和愈伤组织口 ，莴苣（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ） 、番茄

（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）叶片和果实，葡萄（Ｖｉｔｉｓ ｖｉ，

ｎｉｆｅｒａ）的叶片，以及新鲜苹果（Ｍａｌｕｓ ｐｕｍｉｌａ）、梨

（Ｐｙｒｕｓ ｓｐｐ．）、桃（ ｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、草莓（Ｆｒａｇａｒｉａ

ａｎａｒｔａｓｓａ）、桔子（Ｃｉｔｒｕｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）等肉质果实。该

方法的优点主要有：①农杆菌 ｒ基因协助下的

Ｔ—ＤＮＡ转移效率较高，结合真空处理或针管注射可

使农杆菌与植物细胞紧密接触，获得不仅限于组织

表面的表达细胞；②表达细胞呈块状分布，容易分离

并进行ＲＮＡ和蛋白质水平的体外分析；③可以在完

整植株上进行，在用于分析生物或非生物胁迫与外

源基因表达互作时，能够真实反应植株体内的基因

表达模式；④Ｔ—ＤＮＡ的转移还可以携带较大的外源

片段。其缺点是，应用受到物种与农杆菌的亲和性

限制；目前研究的大部分是叶片组织；另外，农杆菌

本身对植物抗病性有潜在影响。

１．３ ＰＥＧ介导原生质体转化的方法

ＰＥＧ法或电击法介导原生质体转化是最早出现

的植物细胞瞬时表达技术，至今仍广泛应用 “。

ＰＥＧ有不同聚合度的产物，相对分子质量为１０００～

６０００的ＰＥＧ均可用作促融剂。ＰＥＧ可以使原生质

体的膜电位降低而进行凝聚。另外，由于ＰＥＧ的脱

水作用，扰乱了分散在原生质膜表面的蛋白质和丁宁发球 脂

质的排列，提高了脂质颗粒的流动性，从而将载体融

合进植物原生质体中完成瞬时转化。该方法的技术

流程包括载体构建、原生质体分离、ＰＥＧ处理原生质

体、转化。影响转化的主要因素有植物种类、原生质

体密度、质粒浓度、ＰＥＧ浓度 、ＰＥＧ的处理时间

等。ＰＥＧ法同基因枪法、农杆菌法一样，在土豆（Ｓｏ．

１ａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、白云杉（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ）、烟草（ ．

ｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、胡椒（Ｐｉｐｅｒ ｎｉｇｒｕｍ）、胡萝卜

（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）等植物中已得到应用 。 。该方法

的优点是对材料的处理可直接作用于单个细胞，从

而可以更直接地研究外源基因在细胞内的瞬时表

达。但是，由于原生质体本身比较脆弱，处理过程中

容易受到破坏，也限制了该方法的应用。另外，直接

利用原生质体表达外源基因，对涉及细胞壁合成、细

胞间互作的基因，组织、器官的特异性基因及发育相

关基因，无法开展研究。

１．４植物病毒栽体介导的方法

植物病毒（大多为ＲＮＡ病毒）载体介导的外源

基因瞬时表达系统近年发展较快。其原理是将目标

基因克隆到植物病毒基因组载体上的启动子下游，

通过体外转录后直接侵染，或借助基因枪、农杆菌等

将其导人植物细胞。目前应用较成功的病毒载体有

马铃薯Ｘ病毒（ＰＶＸ） 、烟草花叶病毒（ＴＭＶ） 、大

麦条斑花叶病毒（ＢＳＭＶ） 和烟草脆裂病毒（ＴＲＶ）

等 ”。该方法的主要优点是：①病毒载体可进入植

株的各种类型细胞，有利于在植株整体水平研究外

源基因的功能；②病毒在植物细胞内大量复制，从而

使外源基因的总体表达获得了极大提高；③外源基

因与病毒外壳蛋白的融合，可以将外源基因产物表

现在病毒颗粒表面，便于提取及分析。此外，ＲＮＡ

病毒会在植物细胞内形成ｄｓＲＮＡ中间体，使其成为

研究ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉ）机理和通过ＲＮＡｉ研究植物基

因功能的较佳手段Ｈ 。其缺点是：①尽管植物的种

类比较繁多，且某些病毒可侵染的宿主种类也很多，

但目前成功开发为转化载体的病毒相对来讲仍然较

少，一些重要的植物还无法使用这些转化载体；②病

毒侵染后，植物的症状可能会对表型分析形成干扰；

③病毒载体所能插入的外源片段较小，且病毒之间

的重组可能会影响表达产物的稳定 “。

２植物瞬时表达技术的应用

近年来，瞬时表达技术的应用越来越多，涉及植

物各方面的研究和生产实践的众多方向，包括生物

制剂的合成、检测转基因的表达、转录元件和转录因

子的克隆与分析 、基因沉默 、细胞定位 ］、蛋白互

２９６ 生 物 技 术 通 讯ｖ，

．２４ Ｎ。．２ Ｍａｒ．，ＬＥＴＴＥＲＳ ＩＮ Ｂ１０ＴＥＣＨＮ０Ｌ０ＧＹ ｏｌ Ｍａｒ…ＺＵＩ３ Ｖ ・ 斗 Ｏ・ ｊ

作分析 、抑制子功能鉴定 、选择性剪接，以及植物

品种的改良和选育等方面。

２．１ 生物制剂的合成

在分子领域时代，２０多年前就已开发出利用瞬

时表达系统生产药用蛋白产品，主要包括单克隆抗

体和疫苗等由植物生产的生物制剂。例如，通过将

烟草花叶病毒载体导人烟草，合成重组单链可变片

段抗体，从而生产霍奇金淋巴瘤个性化治疗疫苗 】，

该实验已进入临床试验评估阶段。最近，将豇豆花

叶病毒蛋白表达系统（ＣＰＭＶ—ＨＴ）导人烟草生产类

病毒颗粒，作为甲型流感病毒Ｈ５Ｎ１亚型疫苗Ｃ４９１，该

研究也已进入临床试验阶段。迄今，药用蛋白生产

主要基于农杆菌瞬时表达和病毒瞬时表达系统。在

农杆菌介导的瞬时表达方面，启动子活性、基因沉

默、密码子使用、蛋白稳定性及亚细胞定位，都是影

响蛋白产量的主要因素。表１、２分别给出了通过农

杆菌和植物病毒载体介导获得的重组分子。

２．２转录元件和转录因子的克隆与分析

利用瞬时表达系统结合报告基因的使用，可以

简便地对植物基因的增强子、启动子等转录元件和

转录因子进行功能分析，这也是瞬时表达系统应用

较早和较成功的领域。Ｍｃｌｎｔｏｓｈ等构建了拟南芥农

杆菌介导的瞬时表达体系，ＣａＭＶ ３５Ｓ启动子与温

度诱导的调控区ＨＳＰＩＯ１Ｂ均提高了ＧＵＳ基因的表

达效率，在农杆菌渗透法转化２周的拟南芥幼苗后

第５ ｄ表达效率最高 。Ｊｏｕｎｇ等构建了基因枪介导

的瞬时转化体系，发现ＧＵＢＱ１启动子在剑兰（Ｇｌａｄｉ．

ｏｌｕｓ ｇａｎｄａｖｅｎｓｉｓ）中对高效表达ＧＵＳ基因有重要影

响，ＧＵＢＱ１启动子在剑兰中的活性与ＣａＭＶ ３５Ｓ启

动子在剑兰、烟草、玫瑰（Ｒｏｓａ ｒｕｇｏｓａ）、水稻、单子叶

植物小苍兰（Ｆｒｅｅｓｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）等中的活性类似，此外

该作者还指出ＧＵＢＱ１启动子在剑兰、玫瑰和小苍兰

与疾病预防相关的遗传工程中有重要作用 。Ｚａ．

ｈｕｒ等采用农杆菌介导的瞬时转化体系，将从棉花

（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｐｐ．）中获得的含有ＧＨＳＰ２６启动子区的

ＤＮＡ删除不同的区域得到多个启动子衍生物，并连

接Ｇ 基因，转入烟草叶片，通过逆境处理分析鉴定

该启动子响应非生物胁迫的区域 。

瞬时表达系统也常用来为研究转录因子的功能

提供活体证据。其方法是将含有目标启动子驱动报

告基因的报告载体和超表达目标转录因子的载体共

同转化，通过转录因子对报告基因表达的调控作用

验证转录因子与启动子的互作。Ｗａｎｇ等以Ｇ 作

为报告基因，通过原生质体瞬时转化，证明了拟南芥

ＭＹＢ转录因子ＧＬ１和ｂＨＬＨ转录因子ＧＬ３能够以互

作的方式与ＧＬ２基因的启动子结合并激活其表达，

从而调控叶片和根部毛状体细胞的分化 。

２－３基因沉默

基因沉默是指基因在生物体内未丢失也未受到

损伤，但不表达或表达量极低。基因沉默是真核生

物细胞基因表达调节的一种重要手段，可以帮助我

们研究植物的各种性状。利用瞬时表达系统可以更

加直观地研究基因沉默。周晓芙在研究植物基因沉

默时，运用农杆菌介导的瞬时表达方法将携带与八

氢番茄红素脱氢酶（ＰＤＳ）基因同源的４０９个碱基大

小的ｃＤＮＡ片段的重组马铃薯Ｘ病毒载体导人烟草

叶片，该ｃＤＮＡ片段的表达阻止了Ｐ报告的写法 ＤＳ基因的表达，

导致ＰＤＳ基因沉默 。

２．４亚细胞定位

亚细胞定位是指某蛋白或表达产物在细胞内的

具体存在部位。发展简单快速的检测蛋白质的亚细

胞定位工具，在解释植物中基因的功能上是必不可

少的。瞬时表达技术结合报告基因，可以有效跟踪

融合产物在细胞内的运输、亚细胞定位及代谢。

Ｚｏｔｔｉｎｉ等 构建了几个以ＧＦＰ为标记，与不同细胞器

中的基因融合的载体来进行亚细胞定位研究。这些

载体分别为：只含有ＧＦＰ的载体，ＧＦＰ：：ＨＤＥＬ载体，

线粒体Ｂ亚基编码的ＦＩ—ＡＴＰ合成酶序列同ＧＦＰ融

合载体，叶绿体３一磷酸甘油酸脱氢酶Ａ１（ＧＡＰＡ１）同

ＧＦＰ融合的载体。研究表明，只含有ＧＦＰ的载体在

表１ 农杆菌介导的瞬时转化系统获得的免疫重组分子产量

接种类型 抑 蓄子 药用蛋白 最高产量 文献

所有参考文献中所用的载体为基于３５Ｓ的双运载体；ａａ：氨基酸；Ｆｗ：鲜重；ＨＰＶ：人类乳头瘤病毒；ｍＡｂ：单克隆抗体

ＨＩＶ：人免疫缺陷病毒；ＳＡＲＳ—ＣｏＶ：ＳＡＲＳ冠状病毒；ＡＭＣＶ：菊芋斑皱病毒；ＴＢＳＶ：番茄丛矮病毒；ＶＬＰ：类病毒颗粒

赵文婷等：植物瞬时表达技术的主要方法与应用进展 ２９７

ＴＭＶ 基于３０Ｂ的调控ＲＮＡ转录的ＴＭＶ载体ＨＩＶ一１破伤风抗毒素蛋白（８６ ａａ）

接种菠菜叶片

ＴＭＶ 基于３０Ｂ的调控ＲＮＡ转录的ＴＭＶ载体ＨＰＶ一１６ Ｌ１蛋白（５３１ ａａ）

接种烟草叶片

ＴＭＶ 基于ＴｏｃＪ的调控ＲＮＡ转录的ＴｏＭＶ 登革病毒包膜蛋白（１０２ ａａ片段）

载体接种烟草叶片

ＴＭＶ 浸润接种烟草叶片 结核杆菌Ａｇ８５Ｂ和ＥＳＡＴ６蛋白（３４２ ａａ）

ＴＭＶ 调控ＲＮＡ转录的ＴＭＶ ＴＴＯ１Ａ载体 由非霍奇金肿瘤病人的肿瘤免疫球蛋白基因

接种烟草叶片 衍生的人单链抗体蛋白（～３０ ｋＤ）

ＴＭＶ ＴＭＶ启动的ｐＢＩＤ４载体浸润接种烟草ｈＧＨ（～３０ ｋｌ３）

叶片

ＴＩ￣ＩＶ和ＰＶＸ编码ｍＡｂ轻重链的２种重组体农杆菌抗癌全长ｍＡｂ（～１６０ ｋＤ）

浸润接种烟草叶片

ＴＭＶ和ＰＶＸ磁选管：编码ｍＡｂ轻重链的２种重组体抗癌全长ｍＡｂ（～１６０ ｋＤ）

农杆菌浸润接种烟草叶片

ＴＭＶ和ＰＶＸ磁选管：编码ｍＡｂ轻重链的２种重组体抗ＷＮＶ的ｍＡｂ（～１６０ ｋＤ）

农杆菌浸润接种烟草叶片

ＴＭＶ 磁选管：浸润接种烟草叶片 鼠疫杆菌Ｆ１（３６２ ａａ）和Ｖ（１５０ ａａ）抗原

ＴＭＶ 磁选管：浸润接种烟草叶片

ＴＭＶ 磁选管：浸润接种烟草叶片

ＴＭＶ 磁选管：浸润接种烟草叶片

ＰＶＸ 基于ｅＤＮＡ文库构建的ｐＰＶＸ２０１载体

接种烟草叶片

ＰＶＸ 基于ｅＤＮＡ文库构建的ｐＰＶＸ２０１载体

浸润接种烟草叶片

ＰＶＸ和ＴＭＶ浸润接种烟草叶片

ＰＶＸ和ＴＭＶ浸润接种烟草叶片

ＶＶ Ｂ５（２７５ ａａ）抗原

疟原虫抗原ＰｙＭＳＰ４／５（３３ ｋＤ）

ＮＶ ｃＰ（～５８ ｋＤ）

ＨＢＶ核蛋白（２１ ｋＤ）

无Ｏ．３￣０．５ ｍｇ／ｇ ＦＷ

有０．０３ｘｌＯ ｍｇ／ｇ ＦＷ

无０．１ ｍｇ ＦＷ

无０．８－１．０ ｍｇ／ｇ ＦＷ

无１００－８００￣ｇ／ｍｌ的叶片

组织液

无Ｏ．７ ｍｇ／ｇ ＦＷ

［５８］

［５９］

【６Ｏ】

【５４］

［４８］

【６１】

无１００￣３００￣Ｌｇ／ｇ ＦＷ， ［５７］

纯化亲和

无０．３－０．５ ｍｇ／ｇ ＦＷ， 【６２】

纯化亲和

无０．８ ｍｇ／ｇ ＦＷ叶片； ［６３］

纯化亲和

无０．３￣０．５ ｍｇ，ｇ ＦＷ； ［６４］

１．２ ｍｇ／ｇ ＦＷ（纯化产品）

无０．１ ｍｇ／ｇ ＦＷ 【６５】

无１～２ ｍｇ／ｇ ＦＷ 【６６】

有０．８ ｍｇ／ｇ ＦＷ 【６７］

有 ０．００５￣０．叭ｍｇ／ｇ ＦＷ ［６８］

融合ＰＶＸ ＣＰ（３１ ｋＤ）结核杆菌ＥＳＡＴ６抗原 无Ｏ．５％一１％的ＴＳＰ

融于ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２和ＶＰ３（４０～５１ ｋＤ）的ＧＦＰ 无 １．２％一５－４％的ＴＳＰ

ＨＢｅ（２１ ｋＤ）和ＮＶ ＣＰ（５８ ｋＤ） 有ＨＢｃ：Ｏ．８０ ｍｇ／ｇ ＦＷ；

ＮＶ ＣＰ：Ｏ．３４ ｍｇ／ｇ ＦＷ

［６９］

［７０］

【７１】

ＨＩＶ：人免疫缺陷病毒；ＣＡＶ：小鸡贫血病毒；ＮＶ：诺沃克病毒；ＰＶＸ：马铃薯ｘ病毒；ＴＭＶ：烟草花叶病毒；ＴｏＭＶ：番茄花叶病毒；

ＶＶ：牛痘病毒；ｗＮＶ西尼罗河病毒；ＨＢＶ：乙型肝炎病毒；ａａ：氨基酸；ＦＷ：鲜重；ＧＦＰ：绿色荧光蛋白；ＨＢｃ：乙肝核心抗原；

ｈＧＨ：人生长激素；ｍＡｂ：单克隆抗体；ＴＳＰ：可溶性蛋白；ＶＬＰ：类病毒颗粒；ＣＰ：外壳蛋白；ＶＰ：病毒蛋白

细胞核和细胞质中都有表达，其余３个载体分别在

内质网、线粒体和叶绿体中表达。该研究利用农杆

菌渗入法较好地进行了亚细胞定位。

２．５蛋白质互作分析

瞬时表达技术结合双分子荧光互补技术

（ＢｉＦＣ），可以更直观地展现蛋白质的相互作用。

Ｏｈａｄ等 在有关ＢｉＦＣ的综述中指出ＢｉＦＣ在检测亚

细胞位置的蛋白互作方面非常有价值。该技术是将

荧光蛋白在合适的位点切开，形成不发荧光的２个

片段，这２个片段借助融合于其上的目标蛋白的相

互作用彼此靠近，重新形成具有活性的荧光蛋白。

文中还列举了许多经ＢｉＦＣ技术核实并鉴定的蛋白

质相互作用的实例。在利用该技术时需要构建瞬时

表达体系来完成检测蛋白的相互作用。Ｍａｒｔｉｎ等

将目的基因导入ｐＳＩＴＥ、ｐＳＩＴＥＩＩ载体，并利用农杆菌

渗人法导人烟草叶片，在共聚焦显微镜下同时结合

ＢｉＦＣ技术检测蛋白质的互作。除此之外，在界定细

胞核或内膜的定位实验中，可表达红色荧光蛋白标

记基因的转基因株系提供了有力的支持。总之，用

来研究细胞内的蛋白质互作、定位及移动的

ｐＳＩＴＥ—ＢｉＦＣ和ｐＳＩＴＥＩＩ载体的新组合与转基因株系

的结合，形成了一个研究植物生理学的强有力工具。

２．６抑制子功能鉴定

基因常常由外部信号控制，这些信号由调控蛋

白传送给基因。调控蛋白中的负调控蛋白又称为抑

制子。瞬时表达技术结合报告基因，可以有效跟踪

抑制子在植物体内的作用。Ｋａｔａｙａ等 在本氏烟野

生型和转基因１６ｃ植株上瞬时表达４个黄瓜黄矮化

失调病毒（ＣＹＳＤＶ）ＲＮＡ １编码蛋白，所得蛋白中只

有ｐ２５能抑制ＲＮＡ干扰的ＧＦＰ ｍＲＮＡ沉默，利用

ｐ２５恢复ＧＦＰ后表达发现没有小ＲＮＡ干扰积累的反

应，从而鉴定出ＣＹＳＤＶ ｐ２５是由病毒ＲＮＡ １分子

编码的抑制子。张凌娣等采用农杆菌浸润方法及重

组马铃薯Ｘ病毒表达载体，研究了甜菜坏死黄脉病

毒（ＢＮＹＶＶ）编码的Ｐ１４蛋白和水稻黑条矮缩病毒

（ＲＢＳＤＶ）编码的Ｓ６蛋白对植物基因沉默的抑制作

用。绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）表型观察及核酸杂交结果

表明，这２种病毒基因均能强烈抑制转基因本生烟

（１６Ｃ）中由同源序列引起的ＧＦＰ基因沉默，ＧＦＰ基

因ｍＲＮＡ的含量明显高于未发生沉默抑制的对照植

株，并导致ＰＶＸ感染后的寄主症状加重，说明它们

可能是由病毒编码的ＲＮＡ沉默抑制因子 １。

２．７选择性剪接调控

选择性剪接（也叫可变剪接）是指从一个ｍＲＮＡ

２９８ 生

ＴＴ

技 术 通 讯ｖ…Ｎ

。．２ Ｍａｒ．，ＬＥ ＳＩＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＯＩ．Ｚｑ＂ Ｍａ ２ｏ１３ Ｉ’ｒＩ’ＥＲ Ｖ ｏ・ｚ ｕｌｊ

前体中通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点

组合）产生不同的ｍＲＮＡ剪接异构体的过程，而最终

的蛋白产物会表现出不同或相互拮抗的功能和结构

特性，或者，在相同的细胞中由于表达水平的不同而

导致不同的表型。解析基因的剪接加工机制，是了

解植物形态建成、生长发育和逆境胁迫应答的重要

环节。高少培等利用农杆菌介导的烟草瞬时表达系

统，分别对单子叶植物水稻ＢＡＤＨ２和双子叶植物拟

南芥 ７基因片段在烟草叶片中的转录后剪接加工

进行分析，结果表明，一些重要剪接调控元件在植物

中保守存在，所以烟草瞬时表达系统可以作为研究

高等植物剪接调控的重要工具，快捷灵敏地检测基

因的剪接加工方式 。

２．８植物品种的改良和选育

将现代遗传转化技术与传统的育种手段相结

合，不仅可以增加植物的种质资源，而且还能改变植

物的各种性状。将抗病的相关基因转入植物，可从

中筛选出既有优良价值，又具较强抗性的植株。瞬

时表达系统可以为植物的遗传转化提供迅速可靠的

依据。孙磊等 为了将基因枪转化方法应用于菊花

（Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）的遗传改良和品种选育，

以ｇｕｓ为报告基因，利用基因枪法将其转入菊花外植

体，检测ｇｕｓ基因在菊花叶盘中的瞬时表达情况。实

验得出了基因枪转化菊花的最佳条件，为菊花基因

枪稳定转化技术提供了参考。为了将基因枪转化方

法应用于佛手（Ｃｉｔｒｕｓ ｍｅｄｉｃａ ｖａＴ．ｓａｒｃｏｄａｃｔｙｌｉｓ）的遗

传改良和品种选育，周春丽等以Ｇ 为报告基因，利

用基因枪法将其转入佛手外植体，通过检测ＧＵＳ基

因在佛手叶盘中的瞬时表达情况，分析了外植体的

幼嫩程度、射程、氦气压力、真空度、轰击次数等参数

对Ｇ 瞬时表达的影响，并研究了最佳检测时间 。

３ 植物瞬时表达技术的应用前景

通过检索近几年的相关文献发现，植物瞬时表

达技术与ＲＮＡｉ、病毒诱导的基因沉默（ｖｉｒｕｓ ｉｎ．

ｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＶＩＧＳ）等技术相结合，在很大

程度上推动了植物功能基因组学的研究。今后植物

瞬时表达技术的发展，需要提高转化细胞及基因产

物的可视水平，增加更多分析的手段。各种报告基

因、荧光探针物质的合理开发和使用，以及同激光共

聚焦显微镜、电镜等显微技术相结合，能提高可视水

平；在分析手段的研究上，可以结合单细胞激光捕获

微分离 等技术对阳性细胞进行分离后的生理、生

化及转录组、蛋白组分析，排除野生型细胞的干扰。

未来的瞬时表达技术同其他各种新技术相结

合，将从现在的单一角度发展到多角度的跟踪和分

析植物细胞内外源基因表达后的分子水平的变化，

且以单个细胞为研究起点，采用其他因素来干扰单

细胞内的生理生化过程，在最终揭开植物生长变化

的神秘面纱中发挥重要作用。

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［４６】ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｏｍ Ｒ Ａ Ｌ，Ｌａｕｒｅｎｔ Ｆ，Ｒｏｔｈ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ａｇｒｏｉｎｆｉｈｒａ—

ｔｉｏｎ ｉｓ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｔｏｏｌ ｔｈａｔ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ

Ａｖｒｇ／Ｃ一９－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｄ Ａｖｒ４／Ｃｆ－４－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｃｒｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ

Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏ Ｉｎｔｅｒａｃｔ，２０００，１３（４１）：４３９－４４６．

［４７】Ｋａｔａｙａ Ａ Ｒ Ａ，Ｓｕｌｉｍａｎ Ｍ Ｎ Ｓ，Ｋａｌａｎｔｉｄｉｓ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｃｕｃｕｒ－

ｂｉｔ ｙｅｌｌｏｗ ｓｔｕｎｔｉｎｇ ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｖｉｒｕｓ ｐ２５ ｉｓ ａ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ

ｐｏｓｔ—ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ，２００９，１４５（１）：

４８—５３．

［４８】ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ Ａ Ａ，Ｒｅｄｄｙ Ｓ，Ｒｅｉｎｌ Ｓ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｐｌａｎｔ－ｐｒｏｄｕｃｅｄ

ｉｄｉｏｔｙｐｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏ－

ｍａ：ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ａ Ｐｈａｓｅ Ｉ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．

Ｐｒｏ Ｎａｔ１ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００８，１０５：１０１３１－１０１３６．

［４９】Ｄ Ａｏｕｓｔ Ｍ Ａ，Ｃｏｕｔｕｒｅ Ｍ Ｍ，Ｃｈａｒｌａｎｄ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃ－

ｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ－ｂａｓｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ：ａ

ｒａｐｉｄ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｓａｆｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｐａｎｄｅｍｉｃ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ［Ｊ］．

Ｐ１ａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１ Ｊ，２０１０，８：６０７—６１９．

［５０］Ｍｅｙｅｒｓ Ａ，Ｃｈａｋａｕｙａ Ｅ，Ｓｈｅｐｈａｒｄ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ

ＨＩＶ一１ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ［Ｊ］．

ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８．８：５３．

［５１］Ｌｏｍｂａｒｄｉ Ｒ，Ｃｉｒｃｅｌｌｉ Ｐ，Ｖｉｌｌａｎｉ Ｍ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｈｉｇｈ—ｌｅｖｅｌ

ＨＩＶ一１ Ｎｅｆ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ｕｓ．

ｉｎｇ ｔｈｅ Ｐ１９ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ａｒｔｉｃｈｏｋｅ

３００ 生

ＴＴ

技 术 通 讯ｖ ０ｌ－２４ Ｎ０

．２ Ｍａｒ．，ＬＥ Ｓ ＩＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｍａｒ ２０１３ ＴＴＥＲ Ｖｏｌ・ ｑ ｌ ０・ ｕｌｊ

ｍｏｔｔｌｅｄ ｃｒｉｎｃｋｌｅ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００９，９６：１—１１．

［５２］Ｍａｃｌｅａｎ Ｊ，Ｋｏｅｋｃｍｏｅｒ Ｍ，Ｏｌｉｖｉｅｒ Ａ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ

ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １６（ＨＰＶ－１６）Ｌ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ

ｐｌａｎｔｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＨＰＶ一１６ Ｌ１

ｇｅｎｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌ—ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ

Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，２００７，８８：１４６０－１４６９．

【５３】Ｚｈｅｎｇ Ｎ，Ｘｉａ Ｒ，Ｙａｎｇ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｂｏｏｓｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ

ＳＡＲＳ—－ＣｏＶ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｍｕｎｏｇｅ—

ｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ［ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００９，２７：５００１—５００７．

【５４】Ｄｏｒｏｋｈｏｖ Ｙ Ｌ，Ｓｈｅｖｅｌｅｖａ Ａ Ａ，Ｆｒｏｌｏｖａ Ｏ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｓｕｐｅｒｅｘ— 可爱的话

ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｌｅａｖｅｓ［Ｊ］，Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ—

ｓｉｓ（Ｅｄｉｎｂ．），２００７，８７：２１８－２２４．

（５５】Ｎｅｇｒｏｕｋ Ｖ，Ｅｉｓｎｅｒ Ｇ，Ｌｅｅ Ｈ ｅｔ ａ１．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｌｅｔｔｕｃｅ［Ｊ］．

Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ，２００５，１６９：４３３—４３８．

［５６］Ｖｉｌｌａｎｉ Ｍ Ａ，Ｍｏｒｇｕｎ Ｂ，Ｂｒｕｎｅｔｔｉ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｐｌａｎｔ ｐｈａｒｍｉｎｇ ｏｆ

ａ ｆｕｌｌ—ｓｉｚｅｄ，ｔｕｍｏｕｒ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｕｓｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓ—

ｓｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｅｈ Ｊ，２００９，７：５９－７２．

［５７１ Ｄｏｒｏｋｈｏｖ Ｙ Ｌ，Ｋｏｍａｒｏｖａ Ｔ Ｖ．Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｎ—

ｔｉ－ＨＥＲ２／Ｎｅｕ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ［Ｐ］．ＷＯ，２００９，

０４８３５４．

【５８】Ｋａｒａｓｅｖ Ａ Ｖ，Ｆｏｕｌｋｅ Ｓ，Ｗｅｌｌｅｎｓ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｐｌａｎｔ ｂａｓｅｄ ＨＩＶ一

１ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ：Ｔａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｓｐｉｎａｃｈ［Ｊ］．Ｖａｃ－

ｃｉｎｅ．２００５．２３：１８７５—１８８０．

［５９】Ｖａｒｓａｎｉ Ａ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ Ａ Ｌ，Ｓｔｅｗａｒｔ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘ—

ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １６ Ｌ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｎｉｃｏ—

ｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ［Ｊ］．

Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ，２００６，１２０：９１—９６．

［６０】Ｓａｅｊｕｎｇ Ｗ，Ｆｕｊｉｙａｍａ Ｋ，Ｔａｋａｓａｋｉ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎ—

ｇｕｅ ２ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｄｏｍａｉｎ ＩＩＩ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｕｓｉｎｇ ＴＭＶ－ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒ

ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００７，２５：６６４６－６６５４．

［６１】Ｒａｂｉｎｄｒａｎ Ｓ，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ Ｎ，Ｒｏｙ Ｇ ｅｔ ａ１．Ｐｌａｎｔ—ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｈｕ・

ｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅｓｈｏｗｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ

［Ｊ】．Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ，２００９，２５：５３０—５３４．

［６２】Ｇｉｒｉｔｃｈ Ａ，Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ Ｓ，Ｅｎｇｌｅｒ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ—ｓｉｚｅ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｅｏｉｎｆｅｃｔｅｄ

ｗｉｔｈ ｎｏｎｃｏｍｐｅｔｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｅ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，

２００６，１０３：１４７０１—１４７０６．

［６３】Ｌａｉ Ｈ，Ｅｎｇｌｅ Ｍ，Ｆｕｃｈｓ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏ—

ｄｕｃｅｄ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｔｒｅａｔｓ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ

ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１０，１０７：２４１９—２４２４．

［６４］Ｓａｎｔｉ Ｌ，Ｇｉｒｉｔｃｈ Ａ，Ｒｏｙ Ｃ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ ｂｙ ｒｅ－

ｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ

ｈｉｇｈｌｙ ｓｃａｌａｂｌｅ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｐｒｏｅ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ

ＵＳＡ，２００６，１０３：８６１－８６６．

［６５】Ｇｏｌｏｖｋｉｎ Ｍ，Ｓｐｉｔｓｉｎ Ｓ，Ａｎｄｒｉａｎｏｖ Ｖ，ｅｔ ａ１．Ｓｍａｌｌｐｏｘ ｓｕｂｕｎｉｔ

ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｐｌａｎｔａ ｃｏｎｆｅｒｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ

Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００７．１０４：６８６４—６８６９．

［６６】Ｗｅｂｓｔｅｒ Ｄ Ｅ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｍｕｌｅａｉｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ。Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒ—

ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒａｌｌｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ

ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｖｉｒｕｓ—ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ［１］．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｂ－

ｎｏｌ Ｊ，２００９，７：１—１０．

【６７］Ｓａｎｔ五年级数学日记 ｉ Ｌ，Ｂａｔｃｈｅｌｏｒａ Ｌ，Ｈｕａｎｇａ Ｚ，ｅｔ ａ１．Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｌａｎｔ ｖｉ－

ｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｏｒａｌｌｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｎｏｒｗａｌｋ

ｖｉｒｕｓ—ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００８，２６：１８４６－１８５４．

［６８】Ｍｅｃｈｔｃｈｅｒｉａｋｏｖａ Ｉ Ａ，Ｅｌｄａｒｏｖ Ｍ Ａ，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ

ｕｓｅ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｃｏｒｅ ｐａｒｔｉ—

ｃｌｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００６，１３１：１０－１５．

［６９】Ｚｅｌａｄ奔驰普尔曼 ａ Ａ Ｍ，Ｃａｌａｍａｎｔｅ Ｇ，ｄｅ ｌａ Ｐａｚ Ｓａｎｔａｎｇｅｌｏ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｅｘ—

ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ ＥＳＡＴ－６ ｉｎ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ

ｕｓｉｎｇ ａ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｘ—ｂａｓｅｄ ｖｅｅｔｏ￣Ｊ】．Ｔｕｂｅｒｃｕｌ０ｓｉｓ（Ｅｄｉｎｂ．），

２００６，８６：２６３—２６７．

［７０］Ｌａｃｏｒｔｅ Ｃ，Ｌｏｈｕｉｓ Ｈ，Ｇｏｌｄｂａｃｈ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓ—

ｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ ａｎｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ，

２００７，１２９：８０—８６，

［７１］Ｈｕａｎｇ Ｚ，Ｃｈｅｎ Ｑ，Ｈｊｅｌｍ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ａ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃｏｎ ｓｙｓｔｅｍ

ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｈｉｇｈ—ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ

［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２００４，１０３：７０６－７１４．

［７２】Ｊｏｕｎｇ Ｙ Ｈ，Ｋａｍｏ Ｋ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ

ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｇｌａｄｉｏｌｕｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，２００６，２５：１０８１－１０８８．

［７３】Ｗａｎｇ Ｓ，Ｃｈｅｎ Ｊ Ｇ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ

ｒｅｖｅａ波本酒 ｌｓ ｔｈａｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＬＡＢＲＡ２ ａａｙ ｒｅｑｕｉｒｅ ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ

ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＧＬＡＢＲＡ１ ａｎｄ ＧＬＡＢＲＡ３ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ＧＬＡ—

ＢＲＡ２［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００８，４９（１２）：１７９２－１８０４．

【７４】周晓馥，徐洪伟．运用农杆菌介导的瞬时表达体系研究ＰＤＳ基

因沉默【Ｊ］．吉林师范大学学报（自然科学版），２００９，（３）：４６－４９．

［７５】Ｏｈａｄ Ｎ，Ｓｈｉｃｈｒｕｒ Ｋ，Ｙａｌｏｖｓｋｙ Ｓ．Ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏ—

ｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｂｙ ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅ・

ｍｅｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ１．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００７，１４５（４）：１０９０－１０９９．

［７６］Ｍａｒｔｉｎ Ｋ，Ｋｏｐｐｅｒｕｄ Ｋ，Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓ—

ｓｉｏｎ ｉｎ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍａｒｋｅｒ ｌｉｎｅｓ ｐｒｏ

ｖｉｄｅｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，ｍｏｖｅｍｅｎｔ

ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｌａｎｔａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ，２００９，５９（１）：１５０—１６２．

［７７］高少培，牛向丽，罗笛，等．利用烟草瞬时表达系统检测高等

植物基因的剪接加工［Ｊ１．生物化学与生物物理进展，２０１０，３７

（６）：６６２—６７０．

［７８】张凌娣，王朝辉，王献兵，等．两种植物病毒编码蛋白的基因

沉默抑制子功能鉴定［ＪＪ＿科学通报，２００５，５０（３）：２１９—２２４．

［７９】孙磊，张启翔．利用ｇｕｓ基因瞬时表达探讨菊花叶盘基因枪转

化参数［ 河南农业科学，２００７，１ １：４１９—４２３．

［８０】周春丽，郭卫东，王德解，等．利用ＧＵＳ基因瞬时表达探索佛

手叶盘基因枪转化参数ｆＪ］．西北植物学报，２００５，２５（１１）：

２１４５—２１５０．

【８ １】Ｋｅｒｋ Ｎ Ｍ，Ｃｅｓｅｒａｎｉ Ｔ，Ｔａｕｓｔａ Ｓ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｌａｓｅｒ ｃａｐｔｕｒｅ ｍｉ—

ｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｎ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００３，１３２

ｆ１）：２７—３５．