皮肤抗氧化

ｌ８卷５期

２００２年９月

生物工程学报

Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

Ｖｏ１．１８ Ｎｏ．５

Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００２

抗氧化剂对皮肤角质细胞体外寿命的影响

周 燕 欧阳安力 华 平 谭文松

（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海２００２３７）

摘 要考察了抗氧化剂对鼠角质细胞体外培养寿命的影响。实验发现在角质细胞的体外培养过程中添加抗氧

化剂有利于延长细胞的寿命，其中效果最好的是巯基乙醇，其次为过氧化氢酶和ＳＯＤ，但在体外培养过程中，角质

细胞生长速率仍然逐渐下降。实验还发现，添加抗氧化剂可在一定程度上提高角质细胞的克隆形成率，减缓细胞

衰老速率。同时，通过考察鼠表皮角质细胞衰老动力学，获得了对应于不同抗氧化剂的细胞衰老动力学常数。

关键词角质细胞，抗氧化剂，体外寿命，细胞衰老

中图分类号Ｑ８１３．１ 文献标识码Ａ 文章编号１０００—３０６１（２００２）０５－０６３０－０４

大面积烧伤病人及皮肤病患者的临床治疗对皮

肤组织的需求一直很大，但临床上能够获得的供体

皮肤组织十分有限，组织工程的发展为解决这一问

题开辟了美好的前景。１９７５年Ｇｒｅｅｎ等人首先培养

成功人工皮肤组织 ，并用于皮肤缺损患者的治

疗 ，成为烧伤治疗领域里的一个里程碑。现在

已有公司开发出了商品化的皮肤组织 ，这些皮肤

都是由皮肤细胞和不同的基质材料构成，构建皮肤

组织时需要大量的成纤维细胞和角质细胞等种子细

胞，所以皮肤种子细胞的培养是当前皮肤组织工爱的传递 程

中一个十分重要的研究课题。经过几十年的发展，

成纤维细胞的培养技术已经日臻完善，但角质细胞

培养仍然是一个难题，这是由角质细胞的特性所决

定的。角质细胞是一种定向干细胞 ，很容易分化，

而且寿命很短。文献报道，氧化损伤是加速细胞衰

老的一种重要机理，但具体添加抗氧化剂对皮肤角

质细胞体外寿命有何影响尚未见报道。

１ 材料与方法

１．１原代角质细胞的分离…

取新生１ｄ的ｓｄ小鼠皮肤，用含有２００ｕ／ｍＬ庆

大霉素的ＰＢＳ清洗３遍，７５％酒精清洗２遍，再用

ＰＢＳ清洗２遍。将皮肤组织加入到２００ｕ／ｍＬ的中性

蛋白酶（Ｓｉｇｍａ）中（中性蛋白酶的量约为被消化皮肤

组织体积的３倍），４￣Ｃ下消化１８ｈ，使真皮和表皮分

离，然后将表皮剪碎，用０、２５％的胰酶（Ｓｉｇｍａ），

０．０２％ＥＤＴＡ（胰酶／ＥＤＴＡ消化液的体积大约为被消

化组织体积的３倍）作用１０ｍｉｎ，并用等量的小牛血

清中和胰酶活性。１５０目筛网过滤，除去皮肤碎块。

２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，倒去上清，ＰＢＳ清洗２遍，加入

角质细胞培养基。

１．２角质细胞培养基

基础培养基为ＭＣＤＢ１５３，补加ｌＯｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ

（Ｍｅｒｃｋ），５￣ｇ／ｍＬ胰岛素，０．４￣ｇ／ｍＬ氢化可的松，

１ｍｇ／ｍＬ转铁蛋白，１１０ ｍｏｌ／Ｌ乙醇胺，２００ｕ／ｍＬ庆

大霉素。为了考察抗氧化剂的影响，分别在开始时

向培养基中添加１００ ｕ／ｍＬ过氧化氢酶，５０ ｕ／ｍＬ

ＳＯＤ．５１０ ｍｏｌ／Ｌ巯基乙醇（如无特殊说明，试剂均

购自Ｓｉｇｍａ）。

１．３细胞培养传代

当细胞生长到６０％～７０％融合时用胰酶／ＥＤＴＡ

进行消化，当细胞变圆、脱落后加入等量小牛血清中

和胰酶活性，用２０００ｒ／ｍｉｎ的速度离心５ｍｉｎ后倒去

上清，ＰＢＳ清洗２遍，加入培养基。细胞接种量为２

１０ ｃｅ１１ｓ，ｃｍ ．每个２５ｃｍ 的培养瓶（ＮＵＮＣ）中加培

养基５ｍＬ，在３７℃、５％ＣＯ 的培养箱（ＲＥＶＣＯ）中培

收稿日期：２００２—０３．２６，修回日期：２００２—０６—２８。

基金项目：本文部分得到国家高技术研究发展计划课题（２００１ＡＡ２１０６４１）、国家重点基础研究发展规划“组织工程的基本科学问题”项目

（Ｇ１９９９０５４３０９）的资助。

＊通讯作者。Ｔｅｌ：８６—２１．６４２５０９４８；Ｆａｘ：８６．２１—６４２５３９０４；Ｅ．ｍａｉｌ：ｗｓｔａｎ＠ｅｃｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃａ

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５期 周 燕等：抗氧化剂对皮肤角质细胞体外寿命的影响 ６３ｌ

养，每３天换液１次。

１．４细胞ＰＤ（Ｐｏｐ￣ａｆｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇｓ Ｊ的测定

细胞计数通过血球计数板来完成，每代末期的

ＰＤ（集落倍增数）是通过公式

ＰＤ＝ｌ。＆ｆ 培养后的总细胞一不能形成克隆的细胞

来计算。实验结果是３次相互独立实验的平均值。

寿命的延长比例＝（ＰＤ 一ＰＤ 。）／ＰＤ… 。

１．５克隆形成率

细胞用１１０ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ的接种密度接种到４８

孔板中，每孔０．５ｍＬ，培养末期计数克隆数。克隆形

成率＝克隆数／接种量１００％，每１０个以上的细胞

为一个克隆。实验结果是３次相互独立实验的平均

值。

１．６ ＳＡ．ｐ．半乳糖苷酶染色

衰老的角质细胞可以通过Ｂ一半乳糖苷酶染色阳

性来判别 ］。在每代的培养末期，细胞用ＰＢＳ缓冲

液洗２遍，然后在室温下用３％的福尔马林固定３—

５ｍｉｎ。再用ＰＢＳ缓冲液和双蒸水清洗，加入新鲜配

制的ＳＡ一．３一半乳糖苷酶染色液：１ｒａｇ／ｍＬ Ｘ—Ｇａｌ（Ｐｒｏ—

ｍｅｇａ），４０ｍｍｏｌ／Ｌ柠檬酸，１２ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钠，

５ ｍｍｏｌ／Ｌ亚铁氰化钾，５ ｍｍｏｌ／Ｌ铁氰化钾，１５０ ｍｍｏｌ／

Ｌ氯化钠，２ ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ氯化镁，在３７℃下过夜。计数细

胞中蓝色细胞的比例，每个样品中最少计数７００个

细胞，衰老细胞的比例就是蓝色细胞的比例。实验

结果是３次相互独立实验的平均值。

２结果和讨论

２．１ 抗氧化剂对角质细胞体外培养的影响

从图１（ａ）中可以发现角质细胞培养过程中添

加抗氧化剂有利于细胞增殖。原代培养中，这种作

用不明显，但随着体外培养时间的延长，抗氧化剂的

作用就逐渐表露出来。和对照组相比，添加了抗氧

化剂的实验组，细胞增殖倍数明显增加。在实验中，

巯基乙醇是最利于细胞生长的，其次是过氧化氢酶，

然后是ＳＯＤ。细胞在培养的前３代都还实现了增

殖，但第４代细胞已经是负增殖。由于ＰＤ是从细

胞分裂次数的角度考察细胞寿命的一个指标，因此

图１（ｂ）中出示了抗氧化剂对角质细胞ＰＤ的影响。

通过和对照组比较，可以发现在体外培养过程中，添

加抗氧化剂后均在不同程度上延长了细胞寿命（表

１）。

Ｅ

０

晶

＝

Ｕ

＿． Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ

Ａ ０ ７ １４ ２１ ２８ ３５

ｔ／ｄ

１３ ２０

ｔ／ｄ

图１ 不同抗氧化剂对角质细胞体外生长的影响

Ｆｉｇ １ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｎｔ／ｏｘｌｄａｎｔｓ Ｏｎ ｔｈｅ ｋｅｒａｔ／ｎｏｃｙｔｅｓ’ｇｒｏｗｔｈ

Ａ．Ｇｍｗｔｈ ＣＵｒＶｅ：Ｂ．Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ＰＤ ｃｕｒｖｅ

表１

Ｔａｂｌｅ １

添加不同抗氧化剂．角质细胞寿命延长的比例

Ｔｈｅ ｌｉｆｅ－ｓｐａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｆ％）ｏｆｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｕｌｌｄｅｒ

ｄ如Ｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ

２．３抗氧化剂对角质细胞体外生长速率的影响

由图２可见，在体外培养过程中角质细胞的生

长速率逐渐下降，这也正是角质细胞体外培养困难

的一个体现。实验中发现，添加了抗氧化剂的实验

组，细胞生长速率都大于对照组，原代时添加了过氧

化氢酶的细胞生长最快，而传代后添加巯基乙醇的

实验组生长最快。

图２抗氧化剂对角质细胞生长速率的影响

Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ￣ｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ

２．４抗氧化剂对角质细胞克隆形成率的影响

图３给出了抗氧化剂对角质细胞克隆形成率的

０ ８ ６ ４ ２ ０ ８ ６ ４ ２ ０

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６３２ 生 物 Ｔ 程 学 报 ｌ８卷

影响。每代培养结果均表明添加巯基乙醇后克隆形

成率最大。虽然添加了ＳＯＤ的实验组，其克隆形成

率大于添加过氧化氢酶组，但得到的细胞却少于后

者，说明添加ＳＯＤ后虽然接种细胞中具有增殖潜能

的细胞数量较多，但其增殖能力却较低。而相反，在

添加了过氧化氢酶的实验组，虽然前体细胞量少，但

每个前体细胞都具有更高的增殖潜能，或说明其前

体细胞保持了更加原始的特性。

Ｉ８ ｏｏ

Ｉ６ ｏｏ

Ｉ４ ｏｏ

Ｉ２ ｏｏ

Ｊ０ ｏｏ

Ｕ ８ ０Ｏ

６ ＯＯ

４ ｏｏ

２ ＯＯ

ｏ ｏｏ

７ ｌ ３ ２Ｏ ２７

ｔ／ｄ

图３抗氧化剂对角质细胞克隆形成率的影响

Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｏｎ ＣＦＥ ｏｆ ｔｈｅ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ

２．５抗氧化剂对角质细胞衰老的影响

Ｂ一半乳糖苷酶染色是目前比较通用的一种判定

细胞衰老的方法。如图４所示，在培养过程中添加

了抗氧化剂后，衰老细胞的比例小于对照组，这说明

添加了抗氧化剂后，细胞的衰老受到了一定的抑制，

因而可以获得更多的细胞增殖倍数。

接下来我们又研究了角质细胞衰老动力学，将

细胞的衰老比例和细胞的ＰＤ进行关联，实验结果

如图５所示。发现原代细胞传代后，衰老细胞的比

例和ＰＤ几乎成线性关系，说明每个ＰＤ中衰老细胞

的比例基本保持恒定。拟合得到的直线的斜率就是

４种条件下的角质细胞衰老动力学常数，Ｋ… 一 。。

＝７．１（％）／ＰＤ，Ｋ ＝８．４（％）／ＰＤ，Ｋｓｏ。＝８．６（％）／

ＰＤ，Ｋ… ＝９．２（％）／ＰＤ，由此可以定量说明抗氧化

剂对减缓角质细胞衰老速率的影响及其程度。

代谢过程中氧自由基积累是造成细胞衰老的一

个重要原因，Ｓｉｔｔｌｅ等人发现在衰老过程中有氧自由

基积累 ；ｖｏｎ Ｚｇｌｉｎｉｃｋｉ等人发现当细胞生长在高氧

浓度下时，细胞复制过程中端粒酶的缩短速率大大

增加，即当细胞生长在这种环境中时它的衰老速率

大大加快 。本文发现抗氧化剂能减缓细胞衰老

速率，可能正是因为抗氧化剂在一定程度上抑制了

端粒酶的缩短速度。前期实验证明，当将角质细胞

曼

忘

２

＆

亏

＝

基

芒

曼

Ｕ

＇兰

８

２Ｏ ＯＯ

００ ＯＯ

２０ ００

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ｔ／ｄ

图４抗氧化剂对细胞衰老的影响

Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ａｇｉｎｇ

图５角质细胞体外衰老比例和ＰＤ的关系

Ｆｉｇ．５ Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｋｅｒａｔｉｏｎｅｙｔｅ

ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ａｎｄ ＰＤ

在低氧浓度下进行培养时，能显著延长细胞寿命，同

时增殖了更多的倍数 。本文实验结果进一步证

实，在角质细胞体外培养过程中，氧化损伤是加速细

胞衰老的一个重要因素。添加抗氧诚信的作文 化剂在一定程度

上延缓了角质细胞的衰老，细胞增殖了更多的倍数。

由于目前几种商品化的角质细胞无血清培养基，均

没有添加适当的抗氧化剂，本文结果提示在角质细

胞无血清培养基研究和优化过程中有必要添加巯基

乙醇等一类抗氧化剂。

ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ（参考文献）

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５期 周 燕等：抗氧化剂对皮肤角质细胞体外寿命的影响 ６３３

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ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｕｓｅ，ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ ｆｏｒ ｃｕｌ—

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ｓｈｏｒｔｅｎｓ ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ

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Ｏｕｙａｎｇ Ａ Ｌ，Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｈｕａ Ｐ Ｔａｎ Ｗ Ｓ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆｌｏｗ ｏｘｙｇｅｎ ｔｅｎｓｉｏｎ

ｏｎ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｌｉｆｅ ｓｐａｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．Ｅｎｚｙｍ Ｍｉ—

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Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ／ｎ ｖｉｔｒｏ Ｌｉｆｅ－ｓｐａｎ ｏｆ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ

ＺＨＯＵ Ｙａｈ ＯＵＹＡＮＧ Ａｎ—Ｌｉ ＨＵＡ Ｐｉｎｇ ＴＡＮ Ｗｅｎ—Ｓｏｎｇ

（Ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＢｉｏｒｅｏｃｔｏｒ Ｅｎｇｔｎｅｅｒｉｎｇ，ＥＣＵＳＴ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３７，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｌｉｒｅ ｓｐａｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｋｅｒ英语主题 ａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ．Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ

ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｉｆｅ ｓｐａｎ ｏｆ ｔｈｅ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｗａｓ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．Ｔｈｅ ｍｏｓｔ 惊蛰的

ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ ｗａｓ ｔｈｅ ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃ对分课堂 ａｔａｌａｓｅ ａｎｄ ＳＯＤ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅｓ

ｏｆ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｕｎｄｅｒ ａｌｌ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｓｔｉｌｌ ｄｅｃｌｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ．Ｉｔ ｗａｓ ａｌｓｏ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｎ—

ｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ａｄｄｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｈｅｌｐｆｕｌ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ ａｇｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ

ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ，ａｎｄ ｆｉｎａｌｌｙ ｔｈｅ ａｇｉｎｇ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｕｓｅｄ

ｗｅｒｅ ｃａｌｃｕ】ａｔｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ，ｌｉｆｅ ｓｐａｎ，ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ，ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ

Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：０３．２６．２００２

Ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ ｗａｓ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ Ｇｒａｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ｈｉｇｈ－Ｔｅｃｈ Ｒ＆Ｄ Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｎｏ．２００１ＡＡ２１０６４１）ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｌａｎ（Ｎｏ

Ｇ１９９９０５４３０９）．

＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ．Ｔｅｌ：８６－２１—６４２５０９４８，Ｆａｘ：８６－２１—６４２５３９０４，Ｅｍａｉｌ：ｗｓｔａｎ＠ｅｃｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ

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