和室

附件4

诺如病毒标本处理和实验室检测技术方案

诺如病毒完整的检测及分型流程包括标本前处理、RNA提取、Real-timeRT-PCR检测、

传统RT-PCR检测、测序和基因分型6个步骤。Real-timeRT-PCR方法灵敏度和准确度高，

是检测诺如病毒的金标准。用传统RT-PCR可对Real-timeRT-PCR阳性标本的PCR产物进行

测序，通过序列分析确定诺如病毒的基因群和基因型。在发生聚集或暴发时，ELISA方法

可作为辅助的手段快速检测诺如病毒抗原。食品、水、环境涂抹样检测方法的灵敏度不稳

定，仅作为参考方法。

一、标本前处理

1.粪便、呕吐物

1.1设备和材料

微量移液器、无菌过滤器、漩涡振荡器、微量离心机、1.5ml无菌离心管、10mMpH值

为7.0—7.4的PBS。

1.2操作方法

（1）离心管每管分装0.5mlPBS。用一次性移液管（或无菌棒）添加豌豆大小的粪便

（约0.1g）,稀释成约10%至20%（重量/体积）的粪便悬浮液。当粪便样品是液态时，

不必在PBS中稀释，直接使用500间的样品。

（2）漩涡振荡每个样品1min。在2400g下离心5min,使得固体沉淀。澄清上清液

可以直接用于病毒核酸提取或贮存于—70℃。

（3）取澄清的上清液200同进行RNA提取。

2.水

通过阴离子滤膜过滤水样品。用牛肉膏（1.5%w/v）含0.05M甘氨酸（pH9.0）缓冲液

洗脱附在膜浙大录取分数线 上的病毒。使用Microp100TM或CentriconTMcolumns离心管进一步浓缩洗

脱液。

2.1设备和材料

DEPC水、新配置次氯酸盐（至少1%）或等效消毒剂、MilliporeHAfilter（孔径

0.45um、）、换膜过滤器、真空泵、计时器、PH值酸度计、磁力搅拌器及转子、低温冰箱（-

20℃、-70℃）、Microp100Kcolumns（PALL公司）、CentriprepYM-50（Millipore

公司）、洗脱液（BE-0.05GlypH7.0）、PBS8口7.个人劳务合同范本 2）、离心机、氯仿、丁醇。

2.2操作方法

2.2.1过滤装置准备

（1）使用无菌的镊子将滤膜放在滤器架上，滤膜有3层，型号分别为MilliporeHA

filter、AP15和AP20,放置顺序为MilliporeHAfilter-AP15fAP20。

注意：暴露出滤膜表面使其能与水样接触，请将滤膜光滑表面的那边向下。所有的玻璃

器皿应干净无菌。每批水样使用不同的漏斗。

（2）将滤膜置中，将有刻度的漏斗放在滤器的上边。

（3）使用不锈钢滤器夹进行水的密封。

（4）真空泵连接1000ml的锥形瓶。

注意：为防止气溶胶的污染，应在无菌的环境中过滤，在生物安全柜进行操作。

（5）向滤器中倒入20ml无菌水（DEPC水）检查滤膜的密封情况。

（6）打开泵，调整水的流速至形成缓慢的细流。

2.2.2水样品的过滤

（1）向玻璃漏斗里倒水样，当水样完全滤过立刻关闭真空泵。

（2）用不锈钢的滤器夹，小心移开滤膜上的刻度漏斗。

2.2.3用酸漂洗滤膜

将膜用无菌的镊子夹放在有200ml0.05mMH2

SO

4

（PH3.0）的无菌500ml烧杯中进行漂洗滤膜

去除Mg2+。

2.2.4洗脱

（1）将膜夹出放在无菌的60mm培养皿中，加5ml洗脱液。盖上铝箔。

注意：要将滤膜的上边向下（倒置）放在锥形瓶里。

（2）将锥形瓶放在恒温摇床上，转速0.01g（45rpm），室温（23℃3℃），

15min。

（3）关闭摇床，将洗脱液（大约5ml）转移到管子里。

2.2.5中和洗脱液

用1NHCl或1NNaOH调整洗脱液的pH至U7.0—7.4。检测前，洗脱液在一70℃

储藏。

2.2.6二次浓缩

方法一：用Microp100Kcolumns或CentriprepYM-50浓缩病毒

（1）为防止病毒的附着，先用无病毒粒子的洗脱液浸湿过滤器。

(2)将水标本滤膜洗脱液(大约5山1)加入到浓缩柱中，24008离心5min。

(3)吸取浓缩液(约150间)，转移至1.5山1离心管中。

方法二：PEG沉淀

(1)向标本洗脱液中加入NaCl终浓度是0.3mol/L(若洗脱液为5ml加0.08775g的

NaCl),有助于病毒的沉淀，再等量加入PEG-6000终浓度为亲爱的的英文 12.5%(w/v)(若洗脱液为5ml,加

0.0625g的PEG-6000。4℃过夜。

(2)4℃,96008离心30min,收集沉淀；

(3)MilliporeHAfilter,倾倒并弃掉上清液。每个离心管添加150—500同

pH7.2(0.2)PBS重悬沉淀物。将离心管放置在离心管架上,为更好的让缓冲液与沉淀物接

触,将离心管架成一定角度放置。室温放置30min。

注意：如果沉淀物没有溶解,可用缓冲液反复的轻轻吹打沉淀物。吹打过力会产生气泡。

(4)向悬液中加入等体积的氯仿/丁醇(1：1vol/vol)混合。去除病毒悬液中的抑制剂。

(5)4℃,96008，离心20min。

(6)分离出水相(上清液),—80℃储藏。

(7)取200间上清液进行核酸提取。

3.环境涂抹样

将棉签在PBS里蘸湿，用力涂抹待测表面(最大面积100cm2)后，立即浸入核酸提取试

剂盒裂解缓冲液中，将棉签用力压EP管的侧壁，释放棉签中的液体。重复浸入和压侧壁的

步骤3~4次,确保病毒最大释放量,直接进入核酸提取步骤。

4.食品

4.1贝类

4.1.1设备和材料：诺如病毒质控样(中国食品药品检定研究院)、高速离心机(可离心

15ml〜50ml体积)、台式离心机、碎花制冰机、生物安全柜、实时荧光定量PCR检测系统、

眼科剪、眼科镊、一次性无菌培养皿、恒温摇床、高压灭菌器、电磨均质器(LX134MO)、一

次性研磨杵(上海生工)、15ml去RNAa离心管、1.5ml去

RNAaEppendorf管、20同、200同、1000间微量移液器、PBS溶液pH7.2(Gebico)、

蛋白酶K(PCR级Roche)。

采集贝类样品，进行解剖，剪取消化腺和肠道后均质，最后提取RNA。

4.1.3解剖方法

5个贝类个体作为一件样品，分别解剖，取其消化腺和肠道，用于检测。如果一件样品

的消化腺和肠道的总质量不够2.0g，应适当增加取样量，使得每件样品检验的总质量达到

2.0g。

（1）牡蛎的解剖方法

使用灭菌的刀具将牡蛎壳撬开，使用灭菌的眼科剪和眼科镊，先将牡蛎的内脏部分剪取

下来放到一个灭菌的平皿里，沿肠道将牡蛎软体部分剪开，暴露出肠道和消化腺，将多余的

组织去掉，取其消化腺和肠道用于检测。牡蛎的解刨过程及解剖结构见

（2）海虹

用灭菌刀具将双壳撬开，将消化腺用镊子直接夹下，同时尽量将肠道取下。由于海虹的

消化腺相对牡蛎较小，所以需要增加取样的海虹个体数，以使得总质量达到2.0g，用于后

续的检测。

（3）扇贝、毛蚶与文蛤

扇贝与毛蚶的解剖结构与海虹相似，参照海虹的方法将壳打开后，直接判断消化腺所处

的位置，用眼科镊和眼科剪，将其消化腺和肠道取下用于诺如病毒的检测。文蛤的消化腺包

在内脏团里，在解剖时可以直接用镊子在内脏团消化腺位置撕开，将消化腺取下，同时将肠

道取出，用于检测，文蛤的消化腺体积较小，需要适当增加取样量以满足检验的要求。

4.1.4均质

将上述解剖下的消化腺和肠道放到50ml灭菌的小烧杯内，用电磨均质器（LX134MO）

将消化腺仔细打碎，成糊状。

4.1.5蛋白酶K消化

将上述均质的消化腺，分别称取2.00.18，加入15ml的离心管，然后每管加入2ml

的PBS溶液，加入20mg/ml蛋白酶K（Roche）溶液10间进行消化，另外取1件样品加

入诺如病毒的阳性质控球，作为外部质控阳性对照。

4.1.6将上述样品于摇床37℃,0.57g（320rpm）振荡1h。恒温水浴60℃,保持15min；

将15ml离心管，3000g离心5min,取200间用于RNA的提取，剩余部分冷冻保存，用于复

检。

4.2.1设备和材料

诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、恒温振荡器、食品均值器、天平：感量

0.1g、高速低温离心机（4℃,10000g）、5XPEG8000/NaCl溶液（PEG80005002g,

NaCl871g,先用450ml蒸馏水溶解，稍微加热，待溶解后定容至1000ml，121℃，15min

灭菌）、磷酸盐缓冲液（PBSpH7.2）、Tris/甘氨酸/牛肉膏缓冲液（TGBE）（Trisba

12.10.2g,甘氨酸3.80.1g,牛肉膏101.0g,蒸馏水10001ml,121℃,15min灭

菌）、氯仿/正丁醇（1:1体积比）溶液。

4.2.2样品处理程序及方法

（1）取三文鱼样品25g,剪碎后置于带滤网的均质袋中，加人TGBE缓冲液40ml,均

质均匀，于室温60r/min震荡20min。

（2）取滤液至50ml新的离心管中，4℃,100008离心30min。

（3）取上清液（小心避开液体表面的油脂层），加入上清液1/4体积的5XPEG/NaCl溶

液，颠倒60s,4℃,60r/min震荡60min。

（4）将上述溶液于4℃,10000g离心30min,弃去上清液。向沉淀物中加入PBS溶

液700间，震荡重悬。

（5）加入与上述重悬液等体积的氯仿/正丁醇（1:1）溶液,充分振荡,室温孵育5min。

于4℃,100008离心1加油的英语怎么说 5min。

（6）取上层水相液体200间用于提取病毒RNA。

4.3草莓、蓝莓

4.3.1设备和材料

诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、PEG8000（Polyethyleneglycol）、

氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、碳酸氢钠（NaHCO3）、磷酸二氢钾（KH2PO3）、磷酸氢二

钠（Na2HPO3）、NaOH溶液（5M）、HCl溶液（1M）、纯水（MilliQ系统净化）、氯仿（Methenyl

trichoride）、丁醇（1-Butanol）、牛肉膏（BeefExtract）、甘氨酸（Glycine）、

蛋白酶K（ProteinaK）、果胶酶（PectinafromAspergilusniger,Sigma）、

5XPEG/NaCl缓冲液（PEG80005002g,NaCl8718,先用450ml蒸馏水溶解，稍微加

热，待溶解后定容至1000ml,121℃,15min灭菌）、TGBE缓冲液

（Trisba12.10.2g,甘氨酸3.80.1g,牛肉膏101.0g,蒸馏水10001ml,

121℃,15min灭菌）、DHZ-D型冷冻恒温振荡器、FE20K型酸度计、小型高速离心机、CR22E

型高速冷冻离心机。

4.3.2样品处理程序及方法

（1）取样称取25g草莓（蓝莓）样本放入滤膜均质袋中，加入40mlTGBE缓冲液，

（取一份样本作为阳性对照，可在这步加入诺如病毒的阳性质控球），以及30单位果胶酶

（PectinafromAspergilusniger,Sigma）

（2）样品提取室温振荡孵育10min，测量pH值。若pH<9.0，用NaOH（5M）溶液小心

调节至9.5，再振荡孵育10min。每调节一次pH值后，孵育10min，直至pH>9.0；将流

出液倒至离心管中（必要情况下使用2个离心管），4℃，100008离心30min；上清移至

一新管或瓶，用HCl（1M）调节pH至7.00.5；

（3）样品富集浓缩加入1/4体积的5XPEG/NaCl缓冲液，在4c条件下，于振荡孵育

器孵育60min；4℃,10000g离心30min（必要情况下将液体分装于2只离心管）；

弃去上层溶液，4℃,再次100008离心5min以使颗粒紧凑；

弃去上层溶液，用500同PBS重悬沉淀。如果一个样品分两管离心，则用同样体积PBS

依次重悬；

将重悬液移至新的EP管中，加入等体积的氯仿/丁醇溶液，涡旋混匀，室温孵育5min。

4℃,100008离心15山血，小心将水相转移至新管待提取RNA。

4.4生菜和苗芽菜

4.4.1设备和材料

食品均质器（可拆卸、可清洗、可高压灭菌）、电子天平（感量0.01g）、台式离心机

（最高转速15000g）、微型离心机、电热恒温水浴锅（0-100℃）、涡旋振荡器、实时荧

光PCR仪、Roche,LightCycler480。

4.4.2样品处理程序及方法

（1）同一批次的生菜或苗芽菜样品，随机抽取样品数不少于5件，并用灭菌处理的剪

刀剪碎至2.5cmX2.5cmX2.5cm大小的形状，称量25g放入带有滤膜均质袋一侧中，作为

待试样品。另称取200g样品放入50ml离心管中，一80℃保存，留作备样，并做好标记。

（2）向上述均质袋中加入40mlTGBEbuffer，均质器拍打混匀，尼龙扎带封口后，室

温振荡约20min。

（3）将均质袋滤膜一侧液体倾入50ml离心管，4℃条件下10000Xg离心30min。

(4)离心结束后，将上清转移至另一50ml离心管，加入1/4倍体积的5皇菊的功效与作用 XPEG/NaCl溶

液，室温条件振荡60min。

(5)振荡完毕，4℃条件下10000*8离心30min。

(6)离心结束，弃上清，继续4℃条件下10000*8离心5min压实沉淀。

(7)向沉淀加入500同PBS溶液以溶解沉淀。吸取溶解沉淀后的PBS溶液200间转移至

无菌离心管中，作为试样。剩余的溶液分装到离心管中标记作为备样，－80℃冻存。

二、核酸提取

各类样品经前处理后，每个样品分别取200同，下面表格中提供的RNA提取试剂盒供参

考，按试剂盒说明书操作提取RNA。

样品种类试剂盒

粪便或呕吐物QIAGEN病毒核酸提取试剂盒(QIAampviralRNAminikit)或

Geneaid病毒核酸提取试剂盒(ViralNucleicAcidExtractionKit

II)

水和环境标本NucliSENSLysisBuffe用DNucliSENSMagnetic试剂盒(梅里埃公司)

食品标本HighPureViralRNAKit(罗氏公司)

三、诺如病毒核酸检测方法

1.方法：(1)样本类型：粪便、呕吐物、肛拭子、水、环境涂抹样；(2)分析方法：采

用诺如病毒双重Real-time(TaqMan)RT-PCR分析：(3)使用范围：ABI7500realtime

PCR、Smartcycler(Cepheid),Mx3005P,Mx3000P(Stratagene)和ICycleriQTMReal-

TimePCR检测系统(BioRad)等。

本设计应用QuantiTectMultiplexRT-PCRKits(Qiagen),引物和探针浓度分别被优

化为终浓度400nM和200nM。每个试剂盒特异的RT最适环境和活化步骤，需要遵循制怎样去胃火除口臭 造

说明书使用。该试验方法来自美国CDC诺如病毒暴发网络(CaliciNet验人)双重Real-

timeRT-PCR操作标准，引物设计参考文献［59］。

2.设备和材料

涡流混合器、微量离心机、移液器(量程为P20、P200和P1000)、Real-timePCR仪可

以是ABI7500(ABI)、Smartcycler(Cepheid)、Mx3005PorMx3000P(Strategene)或

BioRadiCycleriQTMReal-TimePCR检测系统(BioRad)。一次性手套、带滤芯枪头、无菌

1.5ml微量离心管、RNA酶去除剂、96-孔反应板、盖子或薄膜。

3.诺如病毒寡核苷酸引物/探针

表1多重荧光定量RT-PCR扩增诺如病毒的引物和探针

基因型

引物/

探针

序列(5’-3’)工作浓度nM）

Cog1FCGYTGGATGCGITTYCATGA400

GI

Cog1RCTTAGACGCCATCATCATTYAC400

Ring1AFAM-AGATYGCGATCYCCTGTCCA-BHQa200

Ring1BFAM-AGATCGCGGTCTCCTGTCCA-BHQa200

Cog2FCARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG400

GIICog2RTCGACGCCATCTTCATTCACA400

Ring2

JOE-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-

BHQb

200

注：aGITaqMan探针：5'端用FAM荧光素标记，3'端用BHQ淬灭基团标记；BHQ淬灭基

团1更好；bGIITaqMan探针：5'端用JOE（HEX或VIC等）荧光素标记，3'端用BHQ淬灭基

团标记

4.操作方法

（1）实验准备

用RNA酶去除剂擦拭工作台表面、移液器和离心机除去潜在的RNA酶污染。Realtime

PCR仪开机预热15min。

（2）试剂准备

所有试剂冰浴；轻弹管壁混合2XQuantiTectMultiplexRT-PCRMasterMix反应液；

涡旋所有引物和探针5s；

QuantiTectMultiplexRTMix、引物、探针置于冰上。

（3）对照设立

每一次实验都要包括无模板对照（NC）（第一个和最后一个孔各设一个）和阳性对照（PC）

（GI和GII诺如病毒核酸或标准品）。

（4）检测

注意：请在PCR清洁区准备、配制反应体系（mastermix）。

①在1.5山1离心管中准备mastermix；

②确定每次分析的反应数（N），需要多配反应数来弥补重复移液中的小量丢失：

如果样本数（n）（包括NC和VC对照）=1-14，做n+1个反应的mix。

如果样本数（n）（包括NC和VC对照）＞15,做n+2个反应的mix。

③配制Real-timeRT-PCR反应混合液22.5同（表2）

表2诺如病毒双重反应体系配制方案

组成成分体积（闻）终浓度（nM）

RNa-freewater4.25

Cog1F(10uM)1400

Cog1R(10uM)1400

Ring1A(10uM)0.5200

Ring1B(10uM)0.5200

Cog2F(10uM)1400

Cog2R(10uM)1400

Ring2(10uM)0.5200

RNa-freewater4.25

QuantiTectMultiplexRTMix0.25

2XQuantiTectMultiplexRT-PCRMaster

12.51X

Mix

④吸打混匀MasterMix。

⑤按如下方式排列阴性对照、阳性对照和样品，在每孔中加入22.5同MasterMix。

11iT-

ANCS1S2S3S4S5S6S7S8NCPCPC"

(GI)(GII)

B

C

*阴性模板对照(NC)加入第一列，样本加入后面的11列，检查加入样本时可能的交叉污

染。病毒模板对照(PC在所有样本和NC密封后加入到最后。

⑥加入2.5同DEPC水到第一个NC孔，盖好。

⑦将反应平板转移到核酸处理区域或清洁区外面。

⑧将RNA样本从一70C冰箱转移在冰上融化;漩涡振荡5s之后快速离心5s,移液

2.5同RNA样本到标记好的孔。例如，加样本1(S1)到平板位置A2和B2。如果样本体积小

于2.5同，加DEPC水至反应管使总反应体积达到25间。

⑨加2.5用水到最后的NC孔，盖好。

⑩最后，移液GI和GII诺如病毒阳性对照各2.5同到适当的PC孔，盖好。

⑪小心混合平板。

⑫4℃离心平板0.02g(500rpm)1min,以移除孔中可能存在的气泡和液滴。

⑬RT-PCR扩增条件：按照ABI7500(orotherplatform)的说明书放置好平板。终反

应体积为25同。根据QuantiTectMultiplexRT-PCRKits说明书，RT-PCR热循环程序

为：

循环数温度(℃)时间

1

5020min

19515min

459445S

6045S

5.结果解释

(1)阴性对照(NC)

如果一个或更多NC反应出现假阳性，则可能发生了污染。这种情况下，检测无效，需重

复检测。

(2)阳性对照(PC)

阳性对照产生超过阈值的荧光曲线或扩增图像。

(3)检测样本

只有在所有质量控制严格准确时，如果曲线在Ct值为W40,则认为检测样本为阳性。

四、诺如病毒传统RT-PCR分析

原理：人诺如病毒分为5个基因组（Genogroup，G），其中GI、GII和GIV型可感染人。

本方案利用衣壳蛋白的部分区域（regionC）来对诺如病毒进行分型。本方案由四个引物组

成，扩增ORF2的5'末端，编码主要外壳蛋白VP1。引物G1SKF和G1SKR用于GI的检测，扩

增片段330bp。引物和CoG2F和G2SKR用于GII的监测，扩增片段387bp。

1.设备与材料

涡流混合器、微量离心机、移液器、PCR仪、微波炉、电泳仪和制胶器。一次性手套、

带滤芯枪头、无菌1.5ml微量离心管、RNA酶去除剂、薄壁PCR管（Rnafree，0.5ml）、

LoadingBuffer、QiangenOneStepRT-PCRKit（货号：210212）

2.诺如病毒寡核苷酸引物/探针（见表3）

表3诺如病毒传统RT-PCR寡核苷酸引物

Region型别引物名称序列（5'-3'）产物（bp）

G1SKF(+)CTGCCCGAATTYGTAAATGA

I330

CG1SKR(+)CCAACCCARCCATTRTACA

COG2F(+)CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG

II387

G2SKR(-)CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT

3.操作方法

（1）实验准备

用RNA酶去除剂擦拭工作台表面、移液管和离心机以去掉潜在的RNA酶污染。

（2）试剂准备

①所有试剂冰浴。

②轻弹管壁混合5X缓冲液。

③离心酶、RNA酶抑制剂和dNTPs后将其放在冰上备用

④涡旋所有引物5$，离心5s备用。

（3）对照设立

每次PCR实验都应设置阴性对照和阳性对照，包括诺如病第1和GII，阳性对照为阳性

粪便样品。

（4）检测

注意：在PCR清洁区配置反应体系。

①用1.5山1离心管准备反应体系；

②确定每次分析的反应数（N），在操作需配置过量的反应体系来校正重复移液中的小

量丢失；见下面的样本:

♦如果样本数（n）（包括NC和VC对照）=1-14,做n+1个反应的mix。

♦如果样本数（n）（包括NC和VC对照）＞15,做n+2个反应的mix。

③将每个引物对按以下计算量添加到反应混合液中（表4和5）：

表4诺如病毒RegionC反应体系—GenogroupI

成分体积/反应（同）最终浓度

5XRT-PCRBuffer51x

dNTPmix1

Enzymemix1

GISKF(50uM)0.25500nM

GISKR(50uM)0.25500nM

RnaInhibitor(30-40U/

0.50

同）

Rna-freewater12

反应体系总体积20

表5诺如病毒RegionC反应体系—GenogroupII

成分体积/反应（同）最终浓度

5xRT—PCRBuffer51x

dNTPmix1

Enzymemix1

COG2F(50uM)0.25500nM

GIISKR(50uM)0.25500nM

RnaInhibitor(30—40U/

0.50

同）

Rna—freewater12

反应体系总体积20

④用移液管上下吹打混合液；

⑤向每个反应管中分装20间混合液;

⑥设立阴性对照，加5同DEPC水；

⑦将反应管转移到核酸处理区；

⑧将病毒核酸在冰上融化，漩涡振荡5s之后快速离心5$；

⑨移取5同的RNA模板到每一个相应的反应管中；

⑩最后加5间阳性对照；

⑪将所有的反应管放置在PCR仪上，按照下面的条件设置:

循环数时间温度℃

130min42

115min95

30c95

4030c50

30c72

110min72

⑫准备2%的琼脂糖凝胶，进行核酸电泳。

（5）解释

如果阴性对照出现条带，说明可能出现污染，需重复实验。阳性对照在正确位置出现

条带，则判定反应体系工作正常。

五、食品诺如病毒荧光定量PCR（使用罗氏LightMixKitNorovirusGGI,GG

II,MS2或等效的诺如病毒检测试剂盒）

1.反应体系及仪器设置

反应体系的添加按下表：

表6诺如病毒定量PCR体系

试剂1个反应（同）10个反应（同）

PCR水4.347

Activator激活剂1.314.3

引物和探针111

内对照111

预混液7.481.4

模板5

总体积20165

具体的仪器设置为检测信号通道FAM通道465~510nm,内参信号ROX通道533~610

nm,做分型的03670通道498~660nm,反应具体参数设置如下:

（1）逆转录61℃，3min；

（2）预变性95℃，30s；

（3）PCR循环，95℃10s,56℃10s收集信号，72℃5s,45个循环;

（4）溶解曲线，95℃30s，40℃2min,85℃1s收集信号。

2.诺如病毒荧光定量PCR结果判读

实验结束后,分析结果,具体分析标准按下表进行。

表7诺如病毒结果判读

FAM

(510nm)

Rox(610nm)熔解曲线（660nm）

阴性

对照

结果判读

有扩增有无扩增均可无信号无扩增GI型

有扩增有无扩增均可熔解峰在50~60℃无扩增GII型

无扩增有扩增无信号无扩增阴性

无扩增无扩增无信号无扩增

PCR抑制

有扩增有扩增有无信号均可有扩增污染

在食品类的诺如病毒检测方法中,通过诺如病毒质控样的加入作为外部质控以判断

RNA的提取过程是否正常；同时在RT-PCR过程中还含有ROX荧光通道检测内部质控噬菌体

pMS2,用以判断在PCR过程中是否含有PCR抑制物质，如含有抑制物质扩增过程为阴性或扩

增效率不高，正常则扩增为阳性。该试剂盒还含有与GII产物结合的探针，用以区分诺如

病毒的型别。如果扩增的结果为GII,则可以检测到探针信号，如果为GI型则无信号。可

以根据上表来对诺如病毒的检测结果进行判断。

六、诺如病毒ELISA检测方法（粪便、呕吐物）

1.操作步骤（RIDASCREENNorovirus3rdGeneration）：

（1）将两滴（100间）阳性质控液Control”标本稀释液Dilut嬴一|（阴性质控液）

和10％便悬液上清加入为微孔中。

（2）再分别加入2滴（100间）生物素标记抗体标记物1Conjugate1,在充分混匀

（轻轻振动微孔板边缘）后,室温（20~25℃）孵育60min。

（3）每孔加入300间洗液，洗5次，在吸水纸上拍干。

（4）微孔中加入2滴（100同）酶结合物标记物2|"Conjugate2,室温20~25℃孵育30

min。

（5）每孔加入300间洗液，洗5次，在吸水纸上拍干。

(6)在每个孔中加入2滴(100间)的底物Substrate。然后微孔板在室温

(20〜25℃)下避光孵育15min。在每个微孔中加入1滴(50同)终止液StOp"|以终止反

应。轻微混合后(轻拍微孔板的边缘)，用酶标仪测定在450nm的光波下测定吸光度。

(7)结果判定：将阴性质控所得吸光度值加上0.15即为Cut-off值。样本吸光度值大

于Cut-off值10%视为阳性。样本吸光度值处于上述Cut-off值土10%范围视为可

疑，应重复检测。重复测试新鲜粪便样本，结果仍在此区域，则视为阴性。样本吸光度值

小于上述Cut-off值+10%视为阴性。

阴性样品还需按本指南“3.1.1诺如病毒双重Real-time(TaqMan)RT-PCR分析”检

测确认。

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