神经紧张

收稿日期:2005201227;修回日期:2005207229

基金项目:中国原子能科学研究院院长基金资助项目(

TKYZJJ210

)

作者简介:邓新荣(

1970～)

,女(汉族)

,北京人,硕士,从事多肽类放射性药物的研究

通讯作者:李金英,研究员,博士生导师

第18卷第4期

2005年11月

同 位 素

JournalofIsotopes

Vol.18 No.4

Nov.2005

两种125I标记的神经紧张肽

类似物的动物体内分布

邓新荣,李金英

(中国原子能科学研究院同位素研究所,北京 102413

)

摘要:采用氯胺T法对神经紧张肽类似物NT1和NT2进行125I标记,并观察了125I2NT1和125I2NT2在正常

小鼠和荷人结肠癌裸鼠体内的分布。结果显示,125I2NT1和125I2NT2标记率分别为68%和76%,经Sep2

Pak2C18反相柱分离后,放化纯度>98%;两种125I标记的NT类似物血液清除较快,部分由肝、肾脏排泄,体

内分布基本一致,对肿瘤具有相似的靶向性。这说明两种NT类似物N端Arg和Lys互换对其体内的分布

特性没有明显影响。与125I2NT1相比,125I2NT2在体内的清除速度更快,在胃中更稳定,其T/NT也更高,更

适于作进一步研究。

关键词:神经紧张肽类似物;125I标记;生物分布

中图分类号:TL92;R817.937 文献标识码:A 文章编号:100027512

(

2005

)

BiodistributionPropertiesofTwo125I

LabeledNovelNeurotensinAnalogues

DENGXin2rong,LIJin2ying

(

DepartmentofIsotope,ChinaInstituteofAtomicEnergy,Beijing102413,China

)

Abstract:TwonovelneurotensinanaloguesNT1

(

Arg2Lys2Pro2Tyr2TLe2Leu

)

andNT2

(

Lys2Arg2Pro2Tyr2TLe2Leu

)

tribution

studiesof125I2NT1and125I2NT2arecarriedoutinICRmiceandBalb/cnudemicebearing

ultsindicatethat125I2NT1and125I2NT2havesimilarbiodistribu2

tionandspecifictumortargetingproperties.125I2NT2showspromisingprotertiesandis

worthoffurtherinvestigation.

Keywords:novelneurotensinanalgues;125Ilabeling;biodistribtuion

神经紧张肽(

Neurotensin,NT

)由13个氨

基酸残基组成,其序列为Glu2Leu2Tyr2Glu2Asn2

Lys2Pro2Arg2Arg2Pro2Tyr2Ile2Leu。它是一种

脑肠肽,在中枢神经系统和外周组织中都具有生

理功能。NT的生理功能是通过其与细胞表面

的NT受体相互作用而实现[1]。大量研究[2]表

明,神经外分泌肿瘤中常有NT受体过度表达,

因此利用放射性核素标记的NT类似物可对神

://

经外分泌肿瘤进行放射显像和治疗。由于天然

NT的血液半衰期仅为1.5min,限制了其临床

应用。人们正研究开发新的NT类似物。最近

的研究[4]表明,NT的C端六肽NT

(

8～13

)(氨

基酸序列为Arg82Arg92Pro102Tyr112Ile122

Leu13

)显示了天然NT的全部作用,并具有较

长的血液半衰期(

10min

)。本工作拟以NT

(

8

～13

)为基本骨架,为避免肽酶的水解,在其N

端以同为碱性氨基酸的Lys替换第8或第9位

的Arg[5],以Tle替换天然序列中12位的Ile[6],

以设计NT的类似物NT1:Arg2Lys2Pro2Tyr2

Tle2Leu和NT2:Lys2Arg2Pro2Tyr2Tle2Leu;对

二者进行125I标记,并对它们在动物体内的分布

及对结肠癌的靶向性进行比较研究,以探讨二者

在N端Arg和Lys位置互换对其体内分布和肿

瘤靶向性的影响。

1 实验材料

1.1 主要试剂

神经紧张肽(

NT

)的C端六肽NT

(

8～13

)

类似物NT1

(序列为Arg2Lys2Pro2Tyr2Tle2

Leu

)和NT2

(序列为Lys2Arg2Pro2Tyr2Tle2

Leu

)

:本研究小组设计,并委托上海吉尔生化有

限公司合成,分别称取1.0mg溶于0.1mol/L

pH7.4磷酸缓冲液中配制成1g/L的多肽溶

液。氯胺T:Sigma公司产品。Na125I:放射性浓

度7.4TBq/L,原子abs灯亮了怎么消除 高科股份有限公司产品。

Sep2Pak2C18反相柱:Waters公司产品。人结肠

癌细胞株HT29:首都医科大学附属北京中医医

院赠送。DMEM

(

Dulbecco’smodifiedEagles

medium,杜皮克氏改良爱哥尔氏培养基)培养

液:Hyclone公司产品。其它常规试剂皆为分析

纯,购自北京化学试剂公司。

1.2 主要仪器

HP1100高效液相色谱:美国HEWLETT

PARKARD公司产品;LB509高效液相色谱放

射性监测仪:EG&GBERTHOLD公司产品;

SN2695B型智能放免

测量仪:上海原子核研

究所日环仪器厂产品;pH计:德国WTW公司

产品。

1.3 实验动物

昆明种雌性ICR小鼠60只,4～5周龄,18

～勤字开头的成语 20g;Balb/c雌性裸鼠30只,4～5周龄,18～

20g。均由北京大学医学部实验动物部提供。

2 实验方法

2.1 125I2NT1和125I2NT2的制备

分别取10

LNT1和NT2溶液于1.5mL

Eppendorf管中,并在各管中依次加入45

L

0.1mol/LpH7.4磷酸缓冲溶液,10

LNa125I

溶液(

37MBq于0.1mol/LNaOH溶液中)

,10

L新鲜配制的氯胺T溶液(

1g/L于0.1mol/

LpH7.1一12月份的英文缩写 4磷酸缓冲溶液中)

,室温下震荡反应3

min,然后加入50

L偏重亚硫酸钠溶液(

4g/L

于0.1mol/LpH7.4磷酸缓冲溶液中)终止反

应;反应混合液经Sep2PakC18反相柱分离纯

化,纯化后125I标记物经生理盐水稀释至3.7

TBq/L,0.22

m过滤膜灭菌后用于动物体内分

布实验。

2.2 标记率及放化纯度的测定

用HPLC系统(流动相A为0.01mol/L

PBS溶液,pH=7.4;流动相B为乙醇,洗脱速率

1mL/min。在0～25min内洗脱液A从90%

～0%进行线形梯度洗脱,高效液相色谱放射性

监测仪检测)

,分别测量125I标记反应的标记率

及经Sep2PakC18反相柱纯化后125I标记物的放

化纯度。纯化后125I标记物在4℃下放置48h,

不同时间取样用HPLC分析其放化纯度,考察

标记物体外稳定性。

2.3 荷人结肠癌裸鼠动物模型建立

2.3.1 人结肠癌细胞HT29细胞培养 将

HT29细胞株复苏后接种于50cm3培养瓶中,

加入含10%胎牛血清的DMEM培养液之后,在

37℃含5%CO2的培婚不及防 养箱内常规培养,细胞贴

壁生长至融合状态。使用消化液消化传代扩增

至所需用量,在倒置显微镜下进行细胞计数,至

细胞总数为108个,收集细胞,用DMEM培养液

制成浓度为2107/mL的单细胞悬液。

2.3.2 肿瘤细胞接种 取Balb/c裸鼠30只,

于右侧后肢皮下注射100

L

(

2106个细胞)

2.3.1所制得的单细胞悬液,于无菌条件下饲养,

5周后待肿瘤生长至直径约1.0cm时用于体内

分布实验[2]。房屋买卖合同书

2.4 正常小鼠体内分布

取ICR小鼠30只,随机分为6组,每组5

只,每只小鼠经尾静脉注射2.59GBq/L125I2

NT1溶液,分别于注射后0.5、1、2、4、8和24h

从眼球取血后断颈处死,取心、肝、肺、肾、肠、胃

和肌肉等器官,称重并测定其放射性计数,经衰

891同 位 素 第18卷

://

变校正后计算每克组织摄取的放射性占总注射

剂量的百分数(

%ID/g

)。另取30只ICR小鼠

用于NT2实验,方法同NT1。

2.5 荷人结肠癌裸鼠体内分布

取荷瘤裸鼠15只,随机分为3组,每组5

只,每只荷瘤裸鼠经尾静脉注射2.59GBq/L

125I2NT1溶液,分别于注射后1、4和24h从眼

球取血后断颈处死,取出心、肝、肺、肾、肠、胃、肌

肉等器官及肿瘤组织,称重并测定其放射性计

数,经衰变校正后计算每克组织及肿瘤摄取的放

射性占总注射剂量的百分数(

%ID/g

)

,并计算

靶与非靶摄取比(

T/NT

)。应用Prism4.0软件

对数据进行统计学分析。另取15只荷瘤裸鼠用

于NT2实验,方法同NT1。

3 结 果

3.1 125I2NT1和125I2NT2的标记率及放化纯度

NT1和NT2的125I标记率分别为68%和

76%。标记液经Sep2PakC18反相柱纯化后,

HPLC分析显示125I2NT1和125I2NT2放化纯度

均>98%;4℃放置48h后,标记物放化纯度仍

>98%。

3.2 125I2NT1和125I2NT2的正常小鼠体内分布

125I2NT1和125I2NT2正常小鼠体内分布结

果列于表1。由表1可知,125I2NT1和125I2NT2

小鼠体内分布基本相似;血液中放射性清除较

快,肾的放射性分布较高,提示125I2NT主要通过

泌尿系统排泄;其它主要脏器如肝、肺均有较高

的放射性摄取;其在胃及肠道中有较高放射性摄

取,提示125I2NT在体内不稳定,可能有脱碘现

象。

相比较而言,125I2NT1在主要脏器中的摄取

均高于125I2NT2;125I2NT2在体内代谢较快,4h

时血中放射性摄取降低29%,而125I2NT1只下

降了7%,24h时125I2NT2血中残留也较125I2

NT1少。

表1 125I2NT1和125I2NT2的正常小鼠体内分布(xs,n=5)

器官

不同时相的放射性摄取/

(

%ID・g-1)

1h

125I2NT1125I2NT2

4h

125I2NT1125I2NT2

24h

125I2NT1125I2NT2

血8.150.904.130.717.593.752.900.480.490.240.210.09

心2.520.321.040.192.010.450.760.160.130.040.050.01

肺4.170.452.030.343.320.731.700.400.210.060.090.02

肝3.280.350.290.102.800.711.820.280.350.150.060.01

肾4.810.563.371.194.191.011.990.260.200.130.090.01

胃24.311.912.91.2523.08.1212.92.350.510.220.300.09

小肠4.071.061.400.192.400.651.040.250.210.070.060.01

大肠4.460.281.600.403.821.431.080.150.180.100.070.01

肌肉1.830.200.780.271.400.260.530.080.090.030.050.02

3.3 125I2NT1和125I2NT2在荷结肠癌裸鼠体内

的分布

结果列于表2。由表2可知,125I2NT

在荷瘤裸鼠体内分布与正常小鼠的体内分布很

相似。即血中清除较快,放射性主要浓集在胃、

肺和肾,肿瘤组织中也有较高放射性摄取。经统

计分析,125I2NT1和125I2NT2在肿瘤组织和主要

脏器中放射性摄取没有显著性差异,P>0.01。

但125I2NT2在胃中的放射性摄取明显低于125I2

NT1,提示125I2NT2在体内可能较125I2NT1更稳

定。

注射1h时125I2NT1和125I2NT2在关于雪的唯美句子 荷瘤裸

鼠体内的T/NT示于图1。由图1可知,125I2

NT1和125I2NT2在各主要脏器中的T/NT相差

不大,而在肌肉中,T/NT125I2NT1和125I2NT2

的T/NT分别为2.010.66和2.752.40,

125I2NT2略高于125I2NT1。

991 第4期 邓新荣等:两种125I标记的神经紧张肽类似物的动物体内分布

://

表2 125I2NT1和125I2NT2的荷瘤裸鼠体内分布

(xs,n=5)

器官

1h时各脏器的放射性摄取/

(

%ID・g-1)

125I2NT1125I2NT2

血7.791.257.081.95

心1.610.131.910.40

肺4.400.803.290.40

肝2.350.172.340.33

肾4.960.924.420.12

胃20.88.1110.42.64

小肠3.961.543.061.45

大肠2.民主评议登记表 640.212.390.88

肌肉1.770.951.380.54

肿瘤3.550.633.791.30

图1 125I2NT1和125I2NT2的T/NT

□———125I2NT1;■———125I2NT2

4 讨 论

本工作采用神经紧张肽的C端六肽为基本

骨架,为避免Arg82Arg9被金属内肽酶降解和

Tyr112Ile12被血管紧张素转化酶降解[5],用性

质相似或结构相似的氨基酸替换原有序列中的

氨基酸,设计出新的神经紧张肽类似物进行125I

标记,其动物体内分布结果显示,N端氨基酸

Arg和Lys互换对两种类似物的分布没有明显

影响,两者在体内呈现出相似的体内分布和代谢

途径。NT1和NT2从血液中清除后放射性主

要浓聚于肝、肺和肾,并经肾排泄,胃肠道中的

放射性摄取可能与标记的多肽在体内脱碘酶作

用下脱碘有关。本实验采用人源结肠癌细胞株

HT229,能够过度表达神经紧张肽受体

NTR1[2],两种NT类似物在肿瘤组织的较高浓

聚证实125I2标记的NT类似物具有肿瘤靶向性,

是通过NTR1受体介导,具有受体介导特性。

本实验结果提示,125I2NT2在体内的清除速

度比125I2NT1快,在胃中也较稳定,而且其T/

NT也略高于125I2NT1,使其更适合作为进一步

研究的对象。

5 小 结

(

1

)125I标记的NT1和NT2对结肠癌具有

一定靶向性,具有受体介导特性。

(

2

)两种标记物的组织分布很相似,但NT2

比NT1在体内更稳定,适合进一步研究。

致谢:本工作在北京大学医学同位素研究中心完

成,感谢该中心王凡、杜进、沈浪涛等工作人员的马云创业故事

大力支持和协助。

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23

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002同 位 素 第18卷

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