冰浴

以琳生物NINTA蛋白纯化方法

以琳生物ni-nta蛋白纯化方法

伊林生物学

ni-nta纯化系统

一、树脂和柱的特性

2+

镍琼脂糖经镍离子预处理后呈蓝色。Ni-Nta琼脂糖纯化柱具有以下特点：结合能力：

5-10mg蛋白质/ml，树脂平均孔径：45-165微米，建议洗涤速率：0.5ml/min，最大线性

洗脱速率：700cm/h，最大压力：2.8psi（0.2bar）。柱材料：聚丙烯

ph稳定性:长期3-13,短期2-14二ni-nta树脂

Ni琼脂糖可以在细菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞中表达和纯化任何含有六个组氨酸标

签的载体。该树脂具有很高的亲和力，可以选择性地结合带有六个组氨酸标签的重组融合

蛋白。

担保可以在正常、变性或复合条件下利用ni-ntaagaro进行纯化，结合到树脂上的

蛋白可利用低ph缓冲液或用咪唑与组氨酸竞争而被洗脱下来。

三种正常条件与变性条件相同

对六个组氨酸标签蛋白的纯化是应用正常条件还是变性条件取决于蛋白的可溶性及是

否需要保留蛋白的生物学活性。

正常条件：蛋白质在蛋白质溶解后期可溶于上清液，并希望保持蛋白质的活性

变性条件：蛋白裂解后在溶液中，是不可溶性的，并且后期工作不依赖于蛋白的活性

复杂条件：蛋白质不溶于水，希望保持其活性。在变性条件下制备裂解物和柱，然后

在洗脱阶段使用正常缓冲液复性蛋白质。注意：这个过程不能恢复所有蛋白质的活性。

方法

细胞裂解液的制备

㈠准备材料

1正常条件下产生裂解液的正常结合缓冲液2超声波裂解液

310ug/mlrna和5ug/mldnaⅰ（盐酸胍裂解液）4盐酸胍裂解缓冲液（由试剂盒提

供），用于在变性条件下制备裂解物518号针头

6离心机，无菌蒸馏水，7SDS-PAGE样品缓冲液

8用来制备细菌裂解物的溶菌酶

9Bestation或leupeptin用于制备哺乳动物裂解物

㈡制备细胞裂解物―正常条件下

以15000rpm离心50ml培养基5min，丢弃上清液，让细菌沉淀，并用8ml天然结合缓

冲液重新悬浮细菌。2加入8mg溶菌酶，冰浴30分钟

3超声处理,冰浴进行,超声10-15秒停止,再10-15秒超声,停止,为一个循环,共6个

循环即可,或按以下方法进行处理:

在冰浴中用等强度超声波处理2-3，振荡10-15秒，然后迅速将裂解液放入液氮或甲

醇中冷冻，并迅速将裂解液融化至37℃，并在37℃以上重复超声冷冻融化过程2次以上。

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4（可选）如果裂解液非常粘稠，加入RNa（10ug/ml）和DNaI（5ug/ml）冰浴

10-15分钟（或用带有18号针头的注射器反复吸吹几次）5.3000G15分钟，离心并将上清

液放入另一管中

注：此法只适用于可溶性的融合蛋白的纯化。

6.取5ml裂解液进行SDS-PAGE分析，将裂解液储存在冰浴或-20℃中，制备后在正常

条件下纯化。变性条件下细菌细胞裂解物的制备

1．平衡盐酸胍裂解缓冲液至ph7.8,37℃2．5000rpm5min离心，50ml菌液，收获沉淀

3．用1中的盐酸胍裂解缓冲液8ml重悬沉淀4．缓慢搅动细胞5-10min室温进行5．超声

裂解，高强度5s/次，共3次

6.离心3000g，留细胞碎片15min，回收上清液

7．取5ml用语sds-page分析，其余冰浴或-20℃保存备用。㈣昆虫细胞的制备---正

常条件下

1.8mlnativebindingbuffer含有0.5ug/ml亮氨酸蛋白酶抑制剂。2.收获高浓度表

达的昆虫细胞，用8ml天然结合缓冲液在1。3.通过两次冻融循环溶解细胞，并用液氮或

干冰乙醇溶液冻融，使用42℃水浴4。用18号针反复吸吹裂解液4次，去除DNA5.3000g，

离心15min，将上清液移至另一根新试管6。取5ml作为SDS-PAGE，其余在-20℃下备用。

（五）昆虫细胞的制备——变性条件下

1．收获细胞后用8ml盐酸胍缓冲溶液重悬沉淀2．18号针头反复吸吹裂解物，共4

遍3．3000g15min离心，上清移至另一管中

4.取5ml作为SDS-PAGE，其余在-20℃下备用。二、净化过程

㈠在变性条件下的纯化

在变性条件下制备变性缓冲柱和细胞裂解物，并确定pH值正确。1.材料准备

denaturingbindingbuffer

变性缓冲液ⅰph6。0denaturingwashbufferⅱph5。注：（1）确保pH值正确

(2)变性缓冲液中含有尿素随时间过去ph将会升高-nta柱的制备

（1）重新悬浮琼脂糖，轻轻倒置

⑵取2ml树脂加入柱中,重力法或低速离心法使树脂沉淀下去,轻轻吸去上清⑶加6ml

灭菌蒸馏水,反复倒置以重悬树脂⑷沉淀树脂,小心移去上清

（5）6ml变性结合缓冲液（6）重新悬浮树脂，轻轻倒置摇动（7）沉淀树脂，小心

去除上清液（8）重复步骤5-7

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3.变性条件下的纯化

利用变性缓冲液,柱子和细胞裂解物,过程如下:⑴加8ml裂解物至已制好的柱中

（2）在室温下轻轻搅拌（或振动）使其结合15-30分钟，使柱中的树脂始终悬浮。

通过重力法或低速离心法（800g1min）沉淀树脂，并仔细吸收上清液

⑶用4mldenaturingbindingbuffer重悬树脂,晃动2min,重力或低速离心沉淀沉淀树

脂,小心吸取上清,4℃保存上清液,用做sds-page分析,重复1次以上.

（4）使用4ml的呈现洗涤缓冲液ph60重新悬浮树脂，摇动2min，通过重力或低速

离心树脂，仔细吸收上清液，将其储存在4℃下，用于SDS-PAGE分析，并重复一次以上

⑸用4mldenaturingwashbufferph5.3重悬树脂,晃动2min,重力或低速离心沉淀树脂,

小心吸取上清，4℃保存,用做sds-page分析,重复2次以上.

（6）垂直固定柱，打开底部小盖子，用5mld活化液缓冲液洗脱蛋白质，取1ml洗

液，用od280检测洗液，然后在4℃透析过夜，使透析后的洗液与尿素在去除区浓缩

如果仍用此柱纯化同样蛋白,用0.5mnaoh洗树脂30min.用相应的结合缓冲液平衡,若

想再生树脂方法如下:树脂再生:

建议树脂再生次数不超过3次，仅用于纯化同一重组蛋白。如果树脂因镍的洗涤损失

而变白，则再生树脂，并在净化柱中再生2ml树脂

⑴用8ml50mmedta洗柱2次,以洗掉螯合的ni2+⑵用8ml0.5mnaoh洗柱2次,每次摇

2min⑶用8ml无菌去离子水洗柱2次

（4）用8mlnicl26h2o溶液（5mg/ml）清洗柱两次。（5）用8ml无菌去离子水清

洗柱两次

⑹加0.02%叠氮化物或20%乙醇作为保护剂,盖好或封严柱子,室温保存㈡正常条件下

注：试验前，检查所有试剂的pH值是否符合1纯化缓冲液的要求

5×nativepurificationbuffernativebindingbuffernativewashbuffernativeelutionbuf

fer2.所需材料

5×天然纯化缓冲液3M咪唑

naoh,hcl,灭菌去离子水制备ni-nta柱子已制备的细胞裂解物

-NTA的制备

⑴将ni-ntaagaro在瓶中重悬，轻轻地反复倒置小瓶，温柔混合

（2）取1.5ml树脂于10ml纯化柱中，通过重力（10min）或低速离心（800g，1min）

使树脂下沉，然后轻轻吸收上清液。

⑶加6ml灭菌蒸馏水重悬，树脂通过反复倒置轻轻敲打柱子，注意一定要轻。⑷通过

重力或低速离心法使树脂沉下去，小心吸去上清。⑸加6mlnativebindingbuffer重悬树

脂。

.

2+

伊林生物学

⑹沉淀树脂，小心弃去上清，方法同（2）

（7）重复步骤（5）-（7）。4.正常条件下的净化

⑴加入在正常条件下制备的细胞裂解物8ml到已经制备的柱中。⑵轻振荡（或搅拌）

使树脂在裂解液中悬浮，此过程需要30―60min

⑶通过重力或低速离心沉淀树脂，小心吸取上清液，并将其储存在4℃下进行SDS-

PAGE

⑷用8mlnativewashbuffer洗柱，沉淀树脂，小心吸去上清，4℃保存，以做sds-

page用。⑸重复（4）3次以上

（6）垂直固定柱，打开下盖，用8-12ml天然溶液缓冲液洗脱，取1ml进行SDS-

PAGE。

注：洗脱后的成分4℃保存，若需-20℃保存，应添加甘油。若长期保存应加入蛋白酶

抑制剂。若想利用该树脂重新纯化同一种蛋白，先用0.5mnaoh洗30min,而后用相同的

bindingbuffer平衡树脂,树脂的再生详见前面的说明。㈢复合条件下的纯化

注意：使用前一定要检查缓冲液的pH值。如果时间过长，变性缓冲液将变为碱性，

因为它含有尿素。

所需材料：denaturingbindingbuffer

变性蛋白pH6。0nativewashbuffer

nativeelutionbuffer

用变性结合缓冲液制备Ni-NTA柱。

在复合条件下的纯化：

1.向NiNTA柱中加入8ml裂解液。

⒉室温下，在裂解物溶解的过程中保持柱中的树脂悬浮15-30min，动作要柔和。沉淀

树脂用重力或低速离心法使树脂沉下来，小心吸去上清

3.用4ml变性结合缓冲液清洗柱，重新悬浮树脂并摇晃2min，通过重力或低速离心沉

淀树脂，并仔细吸收上清液

在4℃保存上清，做为sds-page分析，重复此步至少一次。

4.用4mld活化洗涤缓冲液洗涤柱，将树脂重新悬浮并摇晃2min，通过重力或低速离

心沉淀树脂，并仔细吸收上清液

在4℃保存上清，做为sds-page分析，重复此步至少一次。

5.用8ml天然洗涤缓冲液洗涤柱，重新悬浮树脂并摇晃2min，通过重力或低速离心沉

淀树脂，并仔细吸收上清液

在4℃保存上清，做为sds-page分析，重复此步至少3次。

⒍垂直夹紧柱，打开底盖，用8-12ml天然溶液缓冲液洗脱蛋白质，取1ml进行SDS-

PAGE分析。