石榴怎么挑

石榴种皮结构及发育过程的显微观察

秦改花;刘春燕;徐义流;李艳玲;齐永杰;潘海发;伊兴凯;高正辉

【摘要】Thestudyonthemicrostructureofedcoatsandthechangesof

theirmicrostructureduringfruitdevelopmentforpomegranatecanenrich

thecytologicalbasisofedcoatsdevelopmentandlaythefoundationfor

study,amodifiedparaffinctionmethodwas

establishedtoobrvethemicrostructureofinnerandouteredcoatand

theirchangesduringthedevelopmentforPunicagranatum

cv.'Yuejishiliu'.Theresultsshowedthatasuccessiveandintegratedwaxfilm

wasobtainedwith2hoursdehydrationandclearingand3days

copicobrvationsrevealedtheedcoatsof

eredcoatwascompodofa

eredcoatwas

compodofacorklayer,athickwallcelllayerandaparenchymacell

roscopicobrvationsofedcoatsduringdevelopment

showedthattherewasanaircavitybetweentheinnerandouteredcoat

intheearlystageoffruitdevelopment,thentheaircavitydisappearedwith

theedcoatsdevelopment,meanwhile,thecellwalloftheoutmostcellin

theinneredcoatthickenedgraduallyanddevelopedtoacork

esultswouldlayafoundationforfurtherstudyontheed

developmentandregulationforpomegranate.%为探明石榴种皮的显微结构

及其发育过程中的变化,从而丰富石榴种皮发育的细胞学基础,进而为调控种皮发育

奠定基础.通过改进石蜡切片方法,对‘月季石榴’果实发育过程中种皮的显微结构

进行研究.结果表明:脱水、透明间隔时间延长至2h,浸蜡时间延长至3d,可获得良好

的切片蜡带.对种皮显微的观察发现,石榴内外种皮由5层细胞组成,外种皮由栅栏层

和薄壁细胞层细胞组成,内种皮由木栓层、厚壁细胞层和薄壁细胞层组成.对不同发

育阶段种皮的显微结构观察发现,发育前期内外种皮间存在明显的空气腔;之后,内外

种皮继续发育,内种皮外层细胞的细胞壁逐渐加厚形成木栓层;内外种皮间的空气腔

消失.该结果为进一步开展石榴籽粒发育的研究奠定良好基础.

【期刊名称】《热带作物学报》

【年(卷),期】2018(039)003

【总页数】5页(P489-493)

【关键词】石榴;种皮;石蜡切片;显微结构

【作者】秦改花;刘春燕;徐义流;李艳玲;齐永杰;潘海发;伊兴凯;高正辉

【作者单位】安徽省农业科学院园艺研究所园艺作物种质创新与生理生态安徽省重

点实验室,安徽合肥230031;果树果实发育与品质生物学安徽省农业科学院重点实

验室,安徽合肥230031;安徽省农业科学院园艺研究所园艺作物种质创新与生理生

态安徽省重点实验室,安徽合肥230031;果树果实发育与品质生物学安徽省农业科

学院重点实验室,安徽合肥230031;安徽省农业科学院园艺研究所园艺作物种质创

新与生理生态安徽省重点实验室,安徽合肥230031;果树果实发育与品质生物学安

徽省农业科学院重点实验室,安徽合肥230031;果树果实发育与品质生物学安徽省

农业科学院重点实验室,安徽合肥230031;安徽省农业科学院园艺研究所园艺作物

种质创新与生理生态安徽省重点实验室,安徽合肥230031;果树果实发育与品质生

物学安徽省农业科学院重点实验室,安徽合肥230031;安徽省农业科学院园艺研究

所园艺作物种质创新与生理生态安徽省重点实验室,安徽合肥230031;安徽省农业

科学院园艺研究所园艺作物种质创新与生理生态安徽省重点实验室,安徽合肥

230031;安徽省农业科学院园艺研究所园艺作物种质创新与生理生态安徽省重点实

验室,安徽合肥230031;果树果实发育与品质生物学安徽省农业科学院重点实验室,

安徽合肥230031

【正文语种】中文

【中图分类】S665.4

石榴（PunicagranatumL.）为千屈菜科（Lythraceae）石榴属（Punica）落叶灌

木或小乔木，原产于伊朗和阿富汗等中亚地区，至西汉张骞出使西域引入中国[1]，

已有2000多年的栽培历史。石榴果实是由革质化果皮包裹的圆形或椭圆形果实，

果皮内部有5～7个心室，每个心室由几十到几百粒种子构成，种子是果实的食用

部位，这与苹果、梨、草莓、桃、李、杏及龙眼等均不同。石榴种皮由内外2层

种皮构成，外种皮肥厚多汁，富含糖、有机酸、多酚等，是主要食用部位。内种皮

富含木质素、纤维素、半纤维素等，是籽粒硬度的主要构成因素。籽粒硬度作为果

实品质的重要因素，严重影响着石榴果实的食用性和商品性，已成为石榴生产和消

费者关注的热点问题。目前对石榴籽粒硬度的研究主要集中在分类、硬软籽粒形成

关键基因的克隆等方面[2-3]，明确石榴种子结构及其发育过程中种皮结构的显微

变化可为石榴籽粒发育和调控研究奠定良好的基础。

石蜡切片是一种广泛使用的植物组织学方法。由于石蜡切片具有切片厚度易于控制、

清晰度好等优点而被广泛用于植物组织的制片及细胞学研究[4]。目前，用于石蜡

切片的植物材料包括胚珠[5-7]、花芽[8-10]、果肉[11-12]和根茎[13]等。石榴

外种皮肥厚多汁，内种皮富含木质素、纤维素而呈木质化，而有关石榴内外种皮间

结构的显微差异观察和发育基础研究还尚未有报道。由于石榴内外种皮间结构差异

较大，这给石榴种皮的显微结构观察带来一定的挑战，本研究将通过改进石蜡切片

法，建立一种适合于石榴种皮显微结构观察的石蜡切片法，明确石榴种子的显微结

构，并对不同发育时期的种皮结构进行显微观察，从而为进一步的石榴籽粒发育和

调控研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

选安徽省内广泛栽培的‘月季石榴’果实为材料。实验仪器有KD-2258石蜡切片

机（金华科迪仪器设备有限公司，浙江金华）、干燥箱、水浴锅、OlympusBX53

荧光显微镜（奥林巴斯，日本东京）、镊子、单面刀、酒精灯、染色缸等。实验药

品有FAA固定液（38%甲醛∶冰醋酸∶70%酒精=1∶1∶18，体积比）、1%番红

染液、0.5%固绿染液、无水酒精、95%酒精、二甲苯、石蜡（上海标本模型厂生

产），熔点56～58℃，中性树胶为上海生工产品，番红和固绿为sigma公司生产，

其余药品均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1取样与固定选取新鲜、无损伤果实3～4个，置于冰盒中并运回实验室；之

后将籽粒完整取出，立即投入FAA固定液中进行固定。

1.2.2脱水与透明将上述完整种子按常规方法进行脱水、透明[11]，各级脱水、透

明时间分别设置3个时间段进行比较（表1）。

1.2.3浸蜡与包埋由于石榴种皮结构的特殊性，本实验用了3种方法浸蜡。第1

种是在高于石蜡熔点（58℃）2℃的条件下，将透明过的材料依次在体积比为

1∶1和体积比为1∶2的二甲苯石蜡混合液及纯石蜡中分别处理4～5h，最后用纯

石蜡重复浸蜡2次，每次4～5h；第2种方法是在第1种方法的基础上，将材料

在纯石蜡中的浸蜡总时间延长至3d，其余方法和步骤与第1种方法相同；第3种

方法是在第1种方法的基础上，将材料在纯石蜡中的浸蜡总时间延长至7d，其余

方法和步骤与第1种方法相同。完全浸蜡的材料，采用常规方法进行包埋。

表1脱水与透明进程Table1Proceduresfordehydrationandclearing步骤试剂

处理时间/hA处理B处理C处理150%乙醇1.522.5260%乙醇1.522.53

70%乙醇1.522.5480%乙醇1.522.5590%乙醇1.522.5695%乙醇1.52

2.57无水乙醇11.528无水乙醇11.529无水乙醇∶二甲苯=2∶11.522.5

10无水乙醇∶二甲苯=1∶21.522.511二甲苯11.5212二甲苯11.52

1.2.4切片与展片将已包埋好的蜡块从纸盒中取出，切成小块，修成梯形。调整蜡

块与刀口之间的角度与位置，使刀片与蜡块间约成15°，切片时摇转速度不可太快，

以40～50r/min为宜。将蜡块切成5～10μm蜡带。切好的蜡带放在40℃蒸馏水

中展片。用镊子夹取切好的蜡带，长约5cm，放于处理好的载玻片上，载玻片置

于预先加热的电热板上，蜡带受热伸展后放于37℃的温箱中过夜。

1.2.5染色、透明、封片采用番红和固绿进行染色[11]，番红染色在37℃条件下

进行，并增加染色时间至48h。

2结果与分析

2.1石榴种皮石蜡切片制作技术的改进

2.1.1脱水、透明及浸蜡的改进不同脱水、透明处理的结果差异较大，在A处理

中，材料放入纯二甲苯时产生了大量白色沉淀，说明材料脱水可能不彻底；在B

处理中，材料放入纯二甲苯时有极少量的沉淀；在C处理中，材料放入纯二甲苯

后虽然没有沉淀，但胚珠的表面出现了少许皱缩，说明材料虽然脱水彻底，但在长

时间的脱水过程中可能破坏了其表皮结构。综上可看出，B处理中，2h的脱水、

透明时间间隔是石榴种皮石蜡切片的最佳脱水、透明进程。除脱水、透明时间外，

浸蜡时间也直接影响切片效果。本研究中用第1种方法浸蜡时，蜡块与材料之间

存在空洞，无法切片，可能是浸蜡不完全；延长纯蜡的浸蜡时间分别到3、7d时，

材料均可完全浸蜡；综合考虑实验效果和时间，石榴种皮石蜡切片中适宜的浸蜡时

间是3d。2.1.2染色方法的改进以常规的番红-固绿二重染色法对石榴种皮切片进

行染色，结果发现番红完全无法染色。因此，本实验调整了番红染色的温度于37℃

下进行，并增加了番红染色的时间。结果表明，只有内种皮表皮木栓层及外种皮内

的针芒结构内部出现红色的颗粒，而木栓层无法染色。

2.2石榴种皮结构的观察

通过观察石榴种皮的显微结构发现，在纵切面上，石榴种皮由大小疏密不同的细胞

形成环状结构，从外到内依次为栅栏层、薄壁细胞层、木栓层、厚壁细胞层和薄壁

细胞层。

外种皮由2层细胞组成，从外到内依次为栅栏层和薄壁细胞层。栅栏层由长柱状、

高度木质化的大细胞构成，细胞的长轴与种皮表面垂直，厚约100～400μm，由

一至多层细胞组成，细胞间无间隙；外珠被内层的薄壁细胞紧靠着栅栏层发育，呈

高度液泡化，一般为多排细胞，其厚度为200～600μm，形状不规则，细胞间间

隙较大。薄壁细胞层内还存在一些体积很小、排列非常紧密、细胞壁增厚的石细胞，

是石榴籽粒特有的、肉眼可见的、呈放射状的针芒结构。

根据细胞壁的加厚情况及大小，石榴内种皮分别由木栓层、厚壁细胞层和薄壁细胞

层3层细胞组成。最外层与外种皮的薄壁细胞相连，是致密的木栓层，细胞厚度

约50μm，胞内原生质体退化，只剩下木栓化和木质化增厚的细胞壁，无细胞间隙。

紧挨木栓层的是薄壁细胞层，由6～10层的形状不规则的薄壁细胞组成。在种子

的成熟过程中，该层薄壁细胞的细胞壁木质化加厚逐渐变成厚壁细胞层，无胞间隙，

而最内层的薄壁细胞层仍为薄壁细胞，排列紧密，有胞间隙。

2.3籽粒发育过程中种皮显微结构的观察

对‘月季石榴’发育过程中种皮显微结构进行观察，结果发现在胚发育早期内外

种皮间有明显的空气腔（图2-a），能看到外种皮清晰的2层细胞结构。内种皮外

层细胞的细胞壁加厚形成厚壁细胞，排列较紧密。胚囊很小，珠被与胚囊之间充满

了珠心细胞。授粉20d后外种皮内层细胞中出现细胞壁结构加厚的区域，胚囊体

积增大（图2-b）。授粉35d后，内外珠被间的空气腔消失，内珠被厚壁细胞继

续加厚，最外层形成了致密的木栓层结构，外种皮的内层细胞出现细胞壁加厚的区

域，即肉眼看到的针芒结构，胚囊继续增大（图2-c）。授粉50d后，外珠被细

胞体积快速增大，外表皮细胞径向伸长明显，发育为栅栏层；内层薄壁细胞体积也

逐渐增大，并呈高度液泡化，胚囊继续增大（图2-d）。

图1石榴种皮的显微结构Fig.1Microstructureofpomegranateedcoats

图2不同发育阶段石榴种皮的显微结构Fig.2

Microstructureofpomegranateedcoatsatdifferentdevelopmentstages

3讨论

石榴内外种皮由内外珠被发育而来，内种皮革质坚硬，外种皮肥厚多汁。本研究通

过改进石蜡制片技术，使脱水、透明的时间间隔延长至2h，浸蜡时间延长至3d，

获得了同时包含内外种皮的完整清晰的石榴种皮石蜡切片。利用改进的切片方法，

从显微结构上明确了石榴内种皮由木栓层、厚壁细胞和薄壁细胞3层细胞组成，

外种皮由薄壁细胞和栅栏组织2层细胞组成。通过观察发育过程中种皮的显微结

构，结果发现在种皮发育前期，内外种皮间有明显的空气腔；随着种皮的发育，外

种皮的内层细胞出现细胞壁加厚的针芒结构，内种皮外层细胞的细胞壁也加厚并逐

渐形成木栓层；内外种皮间的空气腔逐渐消失，而胚囊逐渐增大。

种皮作为石榴果实的食用部分，对其结构进行研究，不仅具有重要的生物学意义，

也有重要的植物学意义。珠被作为种皮的发育前体，珠被的进化可追溯到被子植物

的进化，被子植物几乎都有2层珠被[16]。但在长期进化过程中，珠被厚度发生了

不同程度的分化，有内外珠被等厚的，有内珠被比外珠被厚的，也有外珠被比内珠

被厚的；但多数被子植物是外珠被厚于内珠被或与内珠被等厚[17]。在石榴中，多

数栽培品种的外珠皮厚于内珠被。还有研究结果表明，珠被厚度是基因控制的遗传

性状[18-19]，珠被的厚度由珠被细胞的多少和大小共同决定，珠被细胞数目的多

少在受精前就已决定，而珠被细胞的大小则受后期珠被调控基因表达的影响[19]。

‘月季石榴’授粉后35d是种子硬度形成的关键时期，该时期内珠被最外层细胞

开始出现明显的木质化。木质化是木质素在植物细胞壁积累的结果，也是籽粒硬度

形成的主要基础。本研究结果表明，石榴果实发育后期，而非成熟期是籽粒硬度形

成的关键时期，这与谢小波等[20]的研究结果一致。这说明调控石榴籽粒硬度需选

择在内珠被细胞木质化前进行。

种皮石蜡切片制作的质量直接关系到种皮发育活动的观察结果，进而影响种皮发育

的研究。由于石榴内外种皮结构存在明显差异，给切片过程带来相当困难。本研究

通过改进制片技术，使脱水、透明间隔时间延长至2h，浸蜡时间延长至3d，可获

得良好的切片蜡带。但由于浸蜡时间过长等原因导致染色效果不佳，因此，有关石

榴种皮石蜡切片染色的方法仍需进一步探讨。

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