体膜

盛壑 堂堕 拯 笙第 。卷笔６期Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｍｅｄｌｃａ［Ｃｏｌｌｅｇｅ，２０１５，Ｖｏ１．１０，Ｎｏ．６

网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／５１．１７０５．Ｒ．２０１５１２２２．０９０１．０２２．ｈｔｍｌ

ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４—２２５７．２０１５．０６．００２

大鼠线粒体膜蛋白Ｎｉｘ基因过表达与

ｓｈＲＮＡ慢病毒载体的构建与鉴定 ＊

张君莉 ，黄永秀。，张 红 ，王 丹 ，刘 腾。，李 亚 ，王建东 △

１．成都医学院生物医学系（成都６１０５００）；２．成都医学院检验医学院（成都６１０５００）

３．成都医学院第一附属医院检验科（成都 ６１０５００）

・论 著・

【摘要】 目的构建线粒体膜蛋白Ｎｉｘ基因过表达与ｓｈＲＮＡ慢病毒载体。方法ＰＣＲ扩增获得Ｎｉｘ基因序

列，与经ＢａｒｎＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ双酶切的ｐＨＢＩ Ｖ—ＣＭＶＩＥ—ＩＲＥＳ—Ｐｕｒｏ载体连接获得Ｎｉｘ过表达重组慢病毒载体；以

Ｎｉｘ为靶基因，合成寡核苷酸，退火形成双链ＤＮＡ，与经ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ双酶切的ｐＨＢＬＶ—Ｕ６ Ｓｃｒａｍｂｌｅ—Ｐｕｒｏ载

体连接获得Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ重组慢病毒载体；将病毒包装辅助质粒与上述重组慢病毒载体共转染２９３Ｔ细胞，收集上

清液并浓缩获得慢病毒浓缩液，３倍梯度稀释法测定病毒滴度；用病毒颗粒感染ＰＣ１２细胞，经嘌呤酶素筛后得到

稳定感染细胞株；荧光显微镜检测Ｎｉｘ荧光水平，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测Ｎｉｘ蛋白的表达。结果成功构建Ｎｉｘ基因过

表达和ｓｈＲＮＡ慢病毒载体，并在２９３Ｔ细胞中包装获得病毒。重组病毒感染ＰＣ１２细胞后，荧光显微镜检测Ｎｉｘ

基因过表达细胞荧光水平增加，ｓｈＲＮＡ感染细胞荧光水平降低；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测显示Ｎｉｘ基因过表达ＰＣ１２细

胞中Ｎｉｘ蛋白表达显著升高，ｓｈＲＮＡ慢病毒感染细胞中Ｎｉｘ蛋白表达明显降低，而Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ１干扰效果最好。

结论 成功构建Ｎｉｘ基因过表达与ｓｈＲＮＡ慢病毒载体，并获得Ｎｉｘ过表达与干扰细胞模型。

【关键词】 Ｎｉｘ；ｓｈＲＮＡ；慢病毒载体；ＰＣ１２细胞

【中图分类号】 Ｑ７８ 【文献标志码】 Ａ

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｉｘ Ｇｅｎｅ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｈＲＮＡ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ

Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚｈａｎｇ Ｊｕｎｌｉ ，Ｈｕａｎｇ Ｙｏｎｇａｃｉｕ ，Ｚｈａｎｇ Ｈｏｎｇ ，Ｗａｎｇ Ｄａｎ ，Ｌｉｕ Ｔｅｎｇ。，Ｌｉ Ｙａ１Ａ，Ｗａｎｇ

ＪｉａｎｄｏｎｇＩＡ．１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣｈｅｎｇｄｕＭｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１０５００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１０５００，Ｃｈｉｎａ；３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ

Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆ／ｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６ １０５００，Ｃｈｉｎａ

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ Ｎｉｘ ｇｅｎｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｈＲＮＡ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ

ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｎｉｘ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｏ１ｉｇ０ｎｕｃｋ０ｔｉｄｅｓ

ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ １ｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｐＨＢＩ Ｖ－ＣＭＶＩＥ—ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＢａｍＨ Ｉ ａｎｄ ＥｃｏＲ Ｉ．

Ｔｈｕｓ， Ｎｉｘ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ １ｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ； ｕｓｉｎｇ Ｎｉｘ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ， ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ

ｏｌｉｇｏｎｕｃｋｏｔｉｄｅｓ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｐＨＢＬＶ—Ｕ６一Ｓｃｒａｍｂｌｅ Ｐｕｒｏ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＢａｍＨ

ｆ ａｎｄ ＥｃｏＲ Ｉ．Ｔｈｕｓ，Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌｅｎｔｉｖｉｒａ１ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ；ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ

ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ｐａｃｋａｇｅ ｃｅｌｌｓ ２９３Ｔ ｗｉｔｈ ｈｅｌｐｅｒ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｌｉｑｕｏｒ ｗａｓ

ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｔｏ ａｃｑｕｉｒｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｔｉｔｅｒ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｖｉａ ｔｈｉｒｄ

ｅｃｈｅｌｏｎ ｄｉｌｕｔｉｏｎ：ＰＣ１ ２ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｓｔａｂｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌＩｌｉｎｅｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｂｙ

ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ｎｉｘ ｗａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｉｘ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ

ｂｙ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ Ｎｉｘ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ

ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ａｎｄ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｃｋａｇｅ ｃｅｌｌｓ．Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣ１ ２ ｃｅｌｌｓ ｂｙ

＊基金项目：国家自然科学基金青年基金（Ｎｏ：３１２０１０４５）；四川省应用基础研究计划项目（Ｎｏ：２ｏ１２ＪＹ０１１３）；国家级大学生创新创

业训练计划项目（Ｎｏ：２０１ ５ｌ３７０５０４３）；发育与再生四川省重点实验室基金项目（Ｎｏ：ＳＹＳ１２－００４）

△通信作者：李亚，Ｅ—ｍａｉｌ：６１９５１ ７９１８＠ｑｑ．ｃｏｒｎ；王建东，Ｅ—ｍａｉｌ：２４６８４７０＠ｑｑ．ｃｏｍ

成都医学院学报２０１５年第ｌ０卷第６期Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，２０１５，Ｖｏ１．１０，Ｎｏ．６ ・６４５・

ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ １ｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ，ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｎｉｘ ｏｖｅｒｅｘＤｒｅｓｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｅｌ１ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

１ｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ ｗｅｒｅ ｒｅｄｕｃｅｄ．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｉｎ ＰＣ１ ２ ｃｅｌｌｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ０ｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ １ｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ，

ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｉｘ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ１ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ

Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ Ｎｉｘ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ａｎｄ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｎｉｘ

ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ．

［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ Ｎｉｘ；ｓｈＲＮＡ；Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ；ＰＣ１ ２ ｃｅｌｌｓ

线粒体是细胞能量供应的重要细胞器，能通过

三羧酸循环和氧化磷酸化进行能量转换＿】］。线粒体

健康与否决定了细胞的生存和死亡＿２ ］。大量证据

显示，许多疾病都有一个共同的特征：功能障碍的线

粒体大量堆积，包括心脏疾病 ］、阿尔兹海默症Ｌ６］、

帕金森疾病ｌ＿７］、肿瘤＿８ 和糖尿病等＿＿ｇ］。Ｎｉｘ是近年

来发现定位于线粒体外膜的一类功能蛋白，在调节

细胞自噬和线粒体自噬的过程中发挥着重要作

用＿】 “］。本研究旨在构建Ｎｉｘ基因过表达与

ｓｈＲＮＡ慢病毒载体，为进一步深入探索Ｎｉｘ参与细

胞自噬的分子机制奠定更好的基础。

１材料与方法

１．１ 材料

ＰＣ１２细胞购自中国科学院典型培养物保藏委

员会细胞库。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一Ｎ２一ＦＬＡＧ—Ｎｉｘ质粒

由四川大学华西第二医院姜长安教授惠赠。

ＤＭＥＭ完全培养基购自ＨｙＣｌｏｎｅ公司。胎牛血清

购自以色列ＢｉｏＩｎｄ公司。ＢＣＡ蛋白定量试剂盒购

自碧云天生物科技研究所。抗体ａｎｔｉ—Ｎｉｘ购自Ｃｅｌｌ

Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司。ａｎｔｉ—Ｊ３一ａｃｔｉｎ购自

Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ公司。辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）

标记的羊抗兔或鼠二抗购自ＣＳＴ公司。羊抗兔

Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８购自碧云天公司。ＰＶＤＦ膜和

ＥＣＬ化学发光试剂购自Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司。嘌呤酶素

（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）购自北京索莱宝科技有限公司。Ｎｉｘ

过表达、Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ慢病毒和对照慢病毒由上海汉

恒生物科技有限公司提供。

１．２ 方法

１．２．１ Ｎｉｘ慢病毒表达载体的构建 根据

ＧｅｎＢａｎｋ提供的大鼠Ｎｉｘ基因全长信息，设计ＰＣＲ

扩增引物，以ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一Ｎ２一ＦＬＡＧ—Ｎｉｘ质粒

为模板进行ＰＣＲ扩增。Ｎｉｘ基因序列信息：ＡＴ

ＧＴＣＴＣＡＣＴＴＡＧＴＣＧＡＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣ

ＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＴＧＣＧＡＧＧＡＡＧ Ｇ Ｇ Ｇ

ＡＧＣＡＧＴＣＣＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＣＡＡＣ

ＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＴＡＣＣＣＡＴＧＡ ＡＣ Ａ ＧＣＡ

ＧＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＧＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡ

ＡＴＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＧＴ Ｃ

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ＣＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＴＧＡＧＴＣＧ Ｇ Ｇ Ａ Ｃ Ａ

ＧＡＧＣＡＧＣＴＣＡＡＧＡＧＧＣＡＧＴＴＣＴＣＡＣＴ Ｇ Ｔ Ｇ Ａ

ＣＡＧＣＣＣＴＴＣＡＣＣＡＣＡＡＧＡＡＧＡＣＧＧＧＣ Ａ Ａ Ａ Ｔ

ＡＡＴＧＴＴＴＧＡＴＧＴＴＧＡＧＡＴＧＣＡＣＡＣＣＡ Ｇ Ｃ ＡＧ

ＧＧＡＣＣＡＣＡＧＣＴＣＴＣＡＧＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡ Ａ Ｇ Ｔ

ＴＧＴＡＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＴＴＧＡＧ Ｇ Ｃ Ｔ Ｔ

ＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＧＧＴＡＴＣＡＧＡＣＴ

ＧＧＴＣＣＡＧＴＡＧＡＣＣＣＧＡＡＡＡＣＡＴＣＣＣＡＣＣＣＡＡ

ＡＧＡＧＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧＡＣＡＣＣＣＴＡＡＧ Ｃ Ｇ Ｔ Ｇ Ｃ

ＡＧＣＣＴＣＴＣＴＡＡＧＣＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＡ Ｇ Ｃ

ＣＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＧＧＣＡＴＴＴＴＣＴＣＴＧＣＡ Ｇ Ａ

ＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴ Ｔ Ｃ

ＣＴＣＴＣＴＣＡＣＧＴＧＴＴＧＧＣＴＴＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡ

ＴＣＴＡＴＡＴＣＧＧＡＡＡＡＣＧＡＣＴＧＡＧＣＡＣ Ａ Ｃ Ｃ ＴＴ

ＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＧＡ。将处理好的目的片段

连接到经ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ工双酶切的慢病毒

ｐＨＢＬＶ—ＣＭＶＩＥ—ＩＲＥＳ—Ｐｕｒｏ载体中，转化感受态细

胞ＤＨ５ａ，Ｎｉｘ平板筛选阳性重组子并进行测序鉴

定。靶序列设计与合成均由上海汉恒生物科技有限

公司完成。

１．２．２ Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ慢病毒表达载体的构建 分别

根据Ｇｅｎｂａｎｋ中大鼠Ｎｉｘ基因序列，设计与合成３

对ｓｈＲＮＡ靶序列。其中，正义链５ 端引入ＢａｍＨ

Ｉ酶切位点，反义链５ 端引入ＥｃｏＲ Ｉ酶切位点。

Ｎｉｘ ｓｉＲＮＡ１序列：正义链５，＿ＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＡＧ

ＴＧＧＡＧＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＴ

ＧＧＣＴＣＣＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣ一３ ，反义链５『－ＡＡ

ＴＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＡＧＣＣＡＴＧＡＡＧ

ＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＧＣＴＣＣＡＣＴＣＴＴＣＣ

Ｇ一３ ；Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ２序列：正义链５＇－ＧＡＴＣＣＧ

ＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＴＡＡＴＣＴＴＧＴＣＡＡＴＴＣＡＡ

ＧＡＧＡＴＴＧＡＣＡＡＧＡＴＴＡＴＡＡＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴ

ＴＴＴＴＴＣ一３ ，反义链５＇－ＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＡＣＡＣＣ

成都医学院学报２０１５年第１Ｏ卷第６期Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，２Ｏ１５，Ｖｏ１．１０，Ｎｏ．６

ＡＧＣＡＧＡＴＴＡＴＡＡＴＣＴＴＧＴＣＡＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡ

ＴＴＧＡＣＡＡＧＡＴＴＡＴＡＡＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＧ一３ ；

Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ３序列：正义链５ 一ＧＡＴＣＣＧＣＡＣＴＣＴＧ

ＡＧＧＧＡＡＴＣＴＧＴＧＴＣＴＴＡＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＴＡ

ＡＧＡＣＡＣＡＧＡＴＴＣＣＣＴＣＡＧＡＧＴＧ ＴＴＴＴＴＴ（、－３ ，

反义链５ 一ＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＡＣＡＣＴＣＴＧＡＧＧＧＡ

ＡＴＣＴＧＴＧＴＣＴＴＡＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＴＡＡＧＡＣＡ

ＣＡＧＡＴＴＣＣＣＴＣＡＧＡＧＴＧＣＧ一３ （下划线处为干

扰序列）。将合成的ＤＮＡ单链退火形成双链，连接

到经ＢａｒｎＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ双酶切的慢病毒ｐＨＢＬＶ—

Ｕ６一Ｓｃｒａｍｂｌｅ—Ｐｕｒｏ载体中，转化感受态细胞ＤＨ５ｄ，

Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ平板筛选阳性重组子并进行测序鉴定。

靶序列设计与合成均由上海汉恒生物科技有限公司

完成。

１．２．３ Ｎｉｘ和Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ慢病毒的包装与滴度测

定取对数生长期的２９３Ｔ细胞，接种于７５ ｃｍ。细

胞培养瓶中，接种量８×１０ 个／：Ｋ，于３７℃、５

ＣＯ。条件下培养，待细胞密度达８０ ～９Ｏ％时，按

照汉恒生物Ｌｉｐｏｆｉｔｅｒ 转染试剂说明书操作，将含

有重组子的慢病毒载体与病毒包装辅助质粒共感染

２９３Ｔ细胞。转染４８和７２ ｈ后分别两次收集病毒

上清，以０．４５ ｍ滤器过滤后，于４Ｏ ｍＬ超速离心

管中，４℃、离心１２０ ｍｉｎ（离心半径２０ ｃｍ，转速

７ ０００ ｒ／ｒａｉｎ），５００ Ｌ新鲜培养液重悬病毒沉淀，置

于一８０℃保存。分别取部分慢病毒浓缩液，采用梯

度稀释法测定，并按照滴度（ＴＵ／ｍＩ ）一细胞数百分

比×ＭＯＩ（１）×病毒稀释倍数×ｌＯ。，计算病毒滴

度。慢病毒的包装与滴度测定均由上海汉恒生物科

技有限公司完成。

１．２．４慢病毒感染ＰＣ１２细胞和稳定感染ＰＣ１２细

胞株的筛选 取对数生长期的ＰＣ１２细胞，接种于

２４孔板中，接种量５×１０ 个／：ｆＬ，于３７ ｏＣ、５ ＣＯ

培养２４ ｈ，待细胞密度达８０ ～９Ｏ 时，以病毒液

与培养液体积比１：９的比例，加入对照慢病毒、Ｎｉｘ

和Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ慢病毒进行感染，２４ ｈ后更换新鲜

培养液，４８ ｈ后加入２．５／，ｇ／ｍＬ的ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ筛选

阳性细胞。持续筛选两周后，获得各组慢病毒稳定

感染ＰＣ１２细胞株。

１．２．５ 细胞荧光技术检测Ｎｉｘ荧光数量 取对数

生长期的对照慢病毒、Ｎｉｘ和Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ慢病毒稳

定感染的ＰＣ１２细胞，接种于多聚赖氨酸包被圆玻

片的２４孑Ｌ板中，接种量为５×１０ 个／：ｆＬ，３７℃、５

Ｃｏ 细胞培养箱培养２４ ｈ后，吸去培养基，ＰＢＳ洗

涤３次，冰甲醇一２０℃，固定１５ ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤

３次，加入封闭液室温封闭１ ｈ，吸出封闭液，加入

一抗（Ｎｉｘ １：２００）后，４℃过夜。吸出一抗，ＰＢＳ洗

涤３次，加入二抗（羊抗兔Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ １：５００）

３７℃孵育１ ｈ，吸出二抗，ＰＢＳ洗涤３次，封片，利用

荧光显微镜观察照相。

１．２．６ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测各组慢病毒稳定感染

ＰＣ１２细胞中Ｎｉｘ蛋白的表达 分别收集对照慢病

毒、Ｎｉｘ和Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ慢病毒稳定感染的ＰＣ１２细

胞，加入ｒｉｐａ裂解液冰上裂解３０ ｍｉｎ，于４℃、离心

１５ ｒａｉｎ（离心半径２０ ｃｍ，转速１ ２０００ ｒ／ｍｉｎ），收集

裂解上清液，ＢＣＡ法测定蛋白浓度。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电

泳，每组上样６Ｏ肚ｇ／泳道，ＰＶＤＦ膜湿转６Ｏ～８Ｏ

ｍｉｎ，一抗（Ｎｉｘ １：８００、Ｂ—ａｃｔｉｎ １：５ ０００）４℃孵育过

夜，ＴＢＳＴ洗膜３次，二抗（ＨＲＰ标记的羊抗兔或鼠

二抗１：５ ０００）３７℃孵育１ ｈ，ＴＢＳＴ洗膜３次，凝胶

成像法检测相关蛋白的表达情况。

２ 结果

２．１慢病毒载体的测序鉴定

测序结果显示，Ｎｉｘ过表达载体测序结果与设

计的Ｎｉｘ靶序列完全一致。３条Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ慢病

毒载体序列与设计的３对ｓｈＲＮＡ靶序列完全一致

（图１），表明成功构建针对Ｎｉｘ基因的重组慢病毒

载体。

２．２病毒滴度测定

计算得到各组慢病毒滴度均达到２×１０ ＰＦＵ／

ｍＬ，滴度较高，可以用于下一步实验要求。

２．３ 细胞荧光技术检测各组慢病毒稳定感染ＰＣ１２

细胞中Ｎｉｘ荧光水平

荧光显微镜观察各组慢病毒稳定感染的ＰＣ１２

细胞，显示Ｎｉｘ稳定感染ＰＣ１２细胞与对照细胞相比，

Ｎｉｘ荧光水平明显增强，Ｎｉｘ ｓｈＲＮＡ１稳定感染ＰＣ１２

细胞与对照细胞相比，荧光水平明显减弱（图２）。

２．４ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测各组慢病毒稳定感染ＰＣ１２

细胞中Ｎｉｘ蛋白的表达情况

对各组慢病毒稳定感染ＰＣ１２细胞中Ｎｉｘ蛋白

的表达情况分别进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测，可以看到

Ｎｉｘ基因过表达感染ＰＣ１２细胞中Ｎｉｘ蛋白表达显

著升高（图３）。ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ２和ｓｈＲＮＡ３慢

病毒感染的ＰＣ１２细胞中Ｎｉｘ蛋白表达明显降低，

其中ｓｈＲＮＡ１感染ＰＣ１２细胞中Ｎｉｘ蛋白降低最显

著（图４）。