中P兽医科学 2020,50(12): 1500-1508
Chine Veterinary Science网络首发时间：2020-L0-15 DOI：l0.16656/iissal673-46962020.0206 中图分类号:S852.659.6:S852£59.4 文献标志码:A文章编号：1673-4696(2020)12_ 1500-09猪传染性胃肠炎病毒猪流行性腹泻病毒猪轮状病毒 多重荧光RT-PCR检测方法的建立
许梦怡U，王彦红i，2*，薛峰〇
(1•扬州大学兽医学院，江苏扬州225009;2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同
创新中心，江苏扬州225009;3•江苏省淮安生物T.程高等职业学校，江苏淮安223200;
4.南京农业大学动物医学院，江苏南京210095)
摘要：根据T G E V的M基因、P E D V的M基因和P o R V的V P2基因序列，通过优化引物、探针浓度和退火温度，确定了最佳的反应体系和扩增程序，成功建立了这3种病毒的T a q M a n探针单重荧光定量P C R 方法。在此基础上，经过进一步的条件优化，建立了检测T G E V、P E D V、P o R V的三重实时荧光定量P C R方法，该方法对 T G E V、P E D V、P o R V 的检测灵敏度分别为 2.49copies/M L、4.36copies/fiL、4.96copies/n L, T G E V、P E D V、P o R V的组内重复试验的C V最大值分别为2.5%、3.8%、4.3%，组间重复性试验的C V最大 值分别为3.7%、3.4%、3.2%，均不超过5%，表明建
立的方法重复性好；用此方法对？!^\?(：¥1、？1^^乂病 毒样本进行检测，均没有交叉反应，表明该方法特异性好；用建立的方法对临床4 0份病料样品进行了检测，结果显示，T G E V、P E D V、P o R V的阳性检出率分别为5%、30%、12.5%；其中T G E V与P E D V混合感染率为2.5%;P E D V与P o R V混合感染率为5%；多重荧光定量P C R方法与单一荧光R T-P C R方法的检测结果均一致，表明建立的方法具有很好的临床应用价值：
关键词：猪传染性胃肠炎病毒；猪流行性腹泻病毒；猪轮状病毒；T a q M a n荧光定量P C R
Establishment and application of multiplex RT-PCR procedure for
detection of three virus from swine
XU Meng-yil 3,WANG Yan-hong1'2* ,XUE Feng4*
(1. College of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225009, China；
2.Jia/igsu Co-lnnovaiion Center f or Important Animal Infectious Dias (uid Zoonos,Yangzlwu 225009, China；
3.Huaian Higher Vocational School of B iological Engineering, Jiangsu Province Munian 223200, China ；
4.College of Veterinary Medicine ,Nanjing A griculturaJ University ,l\anjing 2\0095 ,China)
Abstract：Bad on the M gene quence of TGEV and PEDV and VP2 gene quence of PoRV,the optimal reaction system and amplification procedure were established by optimizing primer,probe concentration and annealing temperature,and the Quantitative PCR method of TaqMan probes for three virus is successfully established.On this basis,after further optimization of conditions,a triple real-time fluorescent quantitative PCR method for detecting TGEV,PEDV,and PoRV was established.The detection nsitivity of this method for TGEV,PEDV,and PoRV were 2.49 copies/ fiL,4. 36 copies/M L,and 4.96
收稿日期：2020-08-05；修回日期：2020-10-09
基金项目：江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD)；江苏高校品牌々•业建设工程资助项目（PPZY2015B158)；国家重点 研发计划项目（2017YFF0208600)
作者简介：许梦怡（1990-)，女，江苏淮安人，硕士生，研究方向为兽眹学，E-mail :*****************通讯作者：王彦红(1974-)，女，讲师，博士，研究方向为临床兽医学，E-mail :wyh7405@163. com；薛峰，教授，博士，研究方向为人兽
共患病病原学、致病机制、检测诊断新技术，E-mai 1:xuefeng @njau. edu. cn :
第12期许梦怡等：猪传染性胃肠炎病毒玷流行性腹泻病毒猪轮状病毒多重荧光RT-PCR检测方法的建£1501
copies/respectively.The maximum value of CV in repeated trials detected by TGEV, PEDV and PoRV were 2.5%,3.8%,4. 3%,and the maximum value of CV in repeated trials between groups were 3.7%,3.4%,3.2% , which are no more than 5%. indicating that the established method has good reproducibility.Using this method to detect P R V,PCVl,and PRRSV virus samples,there is no cross-reaction,indicating that the me thod is specific. Using the established method to detect 40 clinical dias,the samples were tested,and the positive rates of TGEV,PEDV,and PoRV were 5%, 30%,and 12. 5% respectively.The mixed infection rate of TGEV and PEDV was 2.5% ,the mixed infection rate of PEDV and PoRV was 5%.The results of the multiple fluorescence quantitative PCR method are consistent with tho of the detection of a single fluorescent RT-PCR method,indicating that the established method has good clinical application value.
Key words：T G E V；PE D V；PoRV；TaqMan quantitative RT-PCR
* C orresponding authors：W A N G Y a n-hon g,E-mail：w y h**********o m；X U E F e n g,E-mail ：xuefeng@
猪传染性胃肠炎病毒（TGEV)、猪流性腹泻病毒（PEDV)以及猪轮状病毒（PoRV)是3种主要引起猪腹泻病的病毒病原13:，这3种病毒性腹泻造成猪场仔猪死亡、成年猪吃而不长，最终导致畜主财产损失，其不仅在我国广泛流行，在欧洲、美洲等地也广泛存在，是一种世界性的疾病。这3种猪腹泻病均为高度接触性肠道疾病，有着相似的临床表现和感染途径，且常常混合感染，临床上较难分辨，主要引 起1周龄以下仔猪呕吐、严重腹泻以及高死亡率，及 早的确诊对该病的防治具有重要意义。实验室常借助病毒分离、ELISA技术、普通RT-PCR技术等进行诊断，然而传统的诊断技术费时费力，敏感性不足，不适于临床快速诊断，也不适于大范围多工作量的流行病学调查。因此，建立特异性强、灵敏度高、重 复性好的检测方法对这3种疾病的诊断和防治具有重要意义。本研究选择了TGEV、PEDV、PoRV高度 保守的M基因[4]、M基因[5]和VP2基因6，设计了多对引物及相应探针，拟应用TaqM an实时荧光定量技术建立这3种病毒的实时多重荧光RT-PCR检测 方法，并将建立的方法投入到实际应用中，对临床采集的病料进行了检测与分析，为将来流行病学调查、疾病防控、疫苗的质量监控、病毒致病机制的研究以及诊断试剂盒的研制提供一种新的技术手段。
1材料与方法
1.1细胞、菌株及毒株
猪传染性胃肠炎病毒（T G E V)、伪犴犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)、猪圆环
病毒（PCV1)为南京农业大学人兽共患病研究室存样。猪流行性腹泻病毒（PEDV)病料来自陕西某规模化猪场送检粪样。猪轮状病毒（PoRV)购自中国菌种保藏中心。P K-15细胞与M A-104细胞购自江阴剑桥生物技术有限公司。
1.2待检临床样品
临床采集猪病料40份，病料来自于扬州大学动物医院，所有样本经实验室分装处理后，于_80°C 保存，待检备用。
1.3主要仪器与试剂
Je n e荧光定量PC R仪购自美国AB1公司。无水 乙醇(分析纯)购自南京生物工程有限公司。琼脂糖凝胶电泳用 5 X loading buffer■和DL2000DNA Marker 购自上海捷瑞生物有限公司。琼脂糖为Biowest公 司产品。QIAamp Viral RNA K it提取试剂盒购自QIAgen 公司。普通 RT-PCR 试剂盒、Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)试剂盒、质粒提取试剂盒、D N A片段 纯化试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司。反 应八联管及管盖购自美国AB1公司。
1.4引物
参照GenBank中TG EV的M基因序列、PEDV 的M基因序列以及PoRV的VP2基因序列，分别设计了针
对这3种病毒的引物以及相对应的TaqMan 水解探针(表1)。
1.5病毒R N A的提取
按照QIAamp Viral RNA Mini K it提取试剂盒使用说明提取病毒RNA。取560y L含有carrier RNA 的AVL buffer，加人140y L细胞培养物或粪样上清，斡旋混匀15s，室温孵育10 min。加入560酒精振荡15 s后瞬离，吸取630m L混合液于吸附柱中离心1m in，再重复离心1次混合液。再分别加人AW1离心，AW2离心，最后加人AVE洗脱液室温孵育后离心得到病毒RNA。
1.6单重荧光RT-P C R方法的建立
1.6.1单重荧光RT-PCR反应条件的优化参照荧光RT-PCR试剂盒说明书所提供的反应条件，以及
1502中国兽医科学第50卷
表1检测TGEV、PE D V和P oR V的引物及探针序列
Table 1Primers and probes quences of TGEV,PEDV and PoRV
引物和探针序列长度/bp
Primers and probes Sequences Products
TGEV-M-F5，-GATCCATTCAGTTGTACAG-3,
TGEV-M-R 5 ^-CCCTGAAAGCAAAGTTAG-S *
TGEV-M-P5f-(FAM)CACCAGTTGGCACACCTTCG(Tamra)-3'
149
PEDV-M-F5,-GCTTGCATCACTCTTATG-3,
PEDV-M-R5,-TCAGGATTGAAAGACCAC-3,
PEDV-M-P5'-(Cy5)CGCCACAACCGAATGCTATTGA(BHQ2)-3'92
PoRV-VP2-F5，-CGCGGAGCTAAACGTGAAAA-3，
PoRV-VP2-R5，-TTACTCTCCATAATTGCGTCTATGTTC-3,93
PoRV-VP2-P5;- (JOE)CCACAACAGAATGAACGTCTGCAAGAAAAA(Eclip)-3^
所选目的基因的片段，对影响荧光R T-P C R的主要
条件进行优化，包括引物浓度、探针浓度以及退火温
度，所有优化反应均采用相同浓度为108copies/nL
的质粒模板（质粒为本实验室提供）。
利用S P S S软件设计三因素三水平正交试验，
优化引物、探针及退火温度，其中引物的优化体积分
另i j为 0.3、0.4、0.5 m L，探针体积为 0.8、1.0、1.2 m L，退
火温度为58、59、60°C。生成的正交试验见表2。
表2 荧光R T-PC R正交试验
Table 2 Fluorescent quantitative RT-PCR orthogonal test
编号Number 引物/>L
Primer
探针/>L
Probe
温度/°c
Temperature
10.5 1.258
20.3 1.060 30•50.860
40. 3 1.259
50.4 1.260
60.5 1.059
70.4 1.058
80.40.859
90. 30.858
1.6.2 单重荧光R T-P C R标准曲线的绘制与敏感性测定以10倍梯度稀释的标准品质粒（109〜103)作为模板，每个样品重复2次，根据已经优化好的荧光R T-P C R反应体系扩增，得到动力学扩增曲线和标准曲线。用108〜10°稀释的标准品质粒作为该反应的 模板，同时设立阴性对照，进行敏感性试验。
1.6.3 单重荧光R T-P C R特异性试验将P R V、P C V1、P R R S V、P E D V、P o R V病毒核酸的反转录产物以及3种病毒核酸的反转录产物混样作为特异性反应的模板来源，用已经优化好的T G E V单重荧光R T-P C R反应体系进行试验，设立阴性对照和标准品阳性对照，当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，特异性试验有效。
同理，P E D V单重荧光R T-P C R反应模板为
P R V、P C V1、P R R S V、T G E V、P o R V、3 种病毒核酸的反转录产物混样；P o R V单重荧光R T-P C R反应模板为 P R V、P C V1、P R R S V、T G E V、P E D V、3 种病毒核酸的反转录产物混样。
1.6.4 单重荧光R T-P C R重复性试验同一次反
应中，设3个浓度的标准品：108、106、104copies/y L，每个样本做3个重复同时检测，用以测定其组内变异系数。将上面3个浓度的标准品质粒分3次重复 检测，每次间隔1周，测定其组间变异系数。
1.6.5 单重荧光R T-P C R与普通R T-P C R的比较对10倍梯度稀释的质粒标准品（1〇9〜10°copies/n L)，同时用荧光R T-P C R和普通R T-P C R检测，比较两 种方法对质粒标准品的检测灵敏度。
1.7 多重荧光RT-P C R方法的建立
1.7.1多重焚光定量R T-P C R反应条件的优化利用S P S S软件设计三因素三水平正交试验，优化引 物、探针及退火温度，其中引物的优化体积分别为0.3、0.4、0.5 y L，探针体积为 0.8、1.0、1.2 p L，退火温度为58、59、60°C。生成的正交试验见表3。
1.7.2多重荧光R T-P C R标准曲线的绘制依照已建立好的多重荧光定量R T-P C R反应条件，将3 个重组质粒标准品用Delution稀释液稀释至10w copies/p L，等体积等浓度均匀混合，然后再用D e- lution依次做10倍梯度稀释直至10° copies/>L, _20°C保存备用。以108〜102copies/M L的新混合 质粒标准品作为模板，进行多重荧光R T-P C R扩增 反应，建立动力学扩增曲线和标准曲线。
1.7.3多重荧光定量R T-P C R特异性试验P R V、P C V1、P R R S V病毒核酸，作为特异性反应的模板来
第12期许梦怡等：猪传染性胃肠炎病毒猪流行性腹泻病毒猪轮状病毒多重荧光RT -PCR 检测方法的建立1503
数量 Quantity
图 1 T G E V (A )、PEDV(B )以及 PoRV(C )单重荧光 R T - PC R 标准曲线
Figure 1
Dynamic range of the single -plex fluorescent quantitative RT-PCR in detecting the recombinant plasmids
2.1.3单重荧光R T -P C R 敏感性试验经过检测， 确定T G E V 单重荧光定量R T -P C R 针对T G E V 的 最低检出限为2.49 copies/ ^ L ，P E D V 单重荧光定量 R T -P C R 针对P E D V 的最低检出限为4.36copies//x L ， P o R V 单重荧光定量R T -P C R 针对P o R V 的最低检
10 20 30 100 200 1 000 10 000 100 000 1 000 000 10 000 000
数量 Quantity
光定量R T -P C R 具有较好的线性关系。其中，T G E V 标准曲线：相关系数^ = 0.998，扩增效率E =1.02; P E D V 标准曲线：相关系数仔=0.997，扩增效率 1.11 ;P o R V 标准曲线：相关系数仔=0.993，扩增效 率E =1.03，见图1。
表3三重荧光R T -PC R 正交试验Table 3 Triple fluorescent quantitative RT-PCR orthogo
nal test
编号
Number 引物/m l P rimer 探针/>L
Probe
温度/°c Temperature
10.5 1.25820• 31. 06030.50.86040• 31. 25950.4 1.26060. 5 1.05970.41. 05880. 40. 8599
0. 3
0.8
58
源，进行多重荧光R T _P C R 扩增，设立阴性对照，验 证多重反应的特异性。1.7.4
多重荧光定量R T -P C R 敏感性试验取
108〜102 copies/^L 的重组质粒标准品，作为模板， 设立阴性对照，进行多重荧光R T -P C R 扩增反应,
用来确定该方法的灵敏性。1.7.5
多重荧光定量R T -P C R 重复性试验组内
重复性试验：取108、106、K )1 copies/p L 的重组质粒 标准品，每个浓度重复3次，在相同条件下，用已优 化好的反应条件进行多重荧光R T -P C R 反应。组间 重复性试验：取108、106、104copies/M L 的重组质粒 标准品，用已优化好的反应条件，每隔一段时间进行 1次反应，共进行3次，对结果进行分析处理，计算 变异系数C V (%)。
1.7.6 多重荧光定量R T -P C R 对现地样品的检测 分析用多重荧光定量R T -P C R 对主要来自华东 地区的40份临床病料进行检测。同时与单重荧光 R T -P C R 对样品的检测结果进行比较。2
结果
2.1 单重荧光R T -P C R 方法的建立
2.1.1单重荧光R T -P C R 反应条件的优化优化结 果显示，T G E V -M -F /T G E V -M -R 为 0.5 p L ,T G E V - M -P 为1.2 n U T ；值为58 °C 得到的扩增曲线最佳; P E D V -M -F /P E D V -M -R 为 0.5 卩 L ，P E D V -M -P 为1.0 M L , 7；值为59 °C 得到的扩增曲线最佳;P o R V - V P 2-F /P o R V -V P 2-R 为 0.4 p L ,P o R V -V P 2-P 为1.2 fxL，Tm 值为60°C 得到的扩增曲线最佳。2.1.2 荧光R T -P C R 标准曲线的绘制用10倍系 列稀释的质粒标准品为模板进行荧光R T _P C R 的 标准曲线绘制，得出检测T G E V 、P E D V 和P o R V 焚
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543210987654
222222211111
1
1504中国兽医科学第50卷
出限为 4.96 copies/p L 。
2.1.4 单重荧光R T -P C R 特异性试验单重荧光 R T -P C R 不与其他病毒核酸反转录产物发生反应，非靶模板及阴性对照均无扩增曲线，靶模板及混样 都出现了特异性的扩增曲线，说明这3种单重荧光 R T -P C R 具有良好的特异性。
2.1.5 单重荧光R T -P C R 重复性试验3种病毒的 单重荧光定量R T -P C R 组内重复试验所用模板的 浓度分别为1 〇8、1 〇6、1 〇4 copies/ P L ，每孔同一条件下 单独重复3次；组间重复性试验所用模板的浓度分
表4 3种病毒单重荧光定量R T -P C R 的重复性试验结果
Table 4 Repeatability of the single-plex fluorescent quantitative RT-PCR
批内重复阈值（CJ
批间重复阈值（Ct )
病毒 ..
Intra-assay repetition threshold Inter-assay repetition threshold
Virus
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------123Avg Ct CV/%7day 14day 21 day Avg Ct
CV/%
13.77
13. 7914.0213. 86 土 0. 14 1.013.8014.0114.9214. 24 土 0.49 3.4TGEV 20.0220.0920.0020. 04 土 0.040.220. 1220.0720.2020.13士 0.050.325.9425.9425. 9025. 93±0. 030. 126.6126.6926. 7126. 67
±0.050. 213.46
13.0813.3913. 31 ±0. 20 1.513.9813. 5413.7413. 75土 0• 18 1.3PEDV 19.4619.9120.0519.81 土 0.31 1.619.4619. 8219.9719. 75±0. 221. 126. 7926.9026.6526. 78±0. 130• 526. 8726. 8526.8926. 87 土 0.020. 118.84
18. 7018.8418. 80 土 0.080.418.8418. 7518.9918. 86 士 0. 100.5PoRV 25.9125.5225.5825. 67±0. 210.825.9826.0126. 1926. 06 士 0.090.432. 75
36. 52
32. 75
32. 67±0. 14
0.4
32.96
34.09
33.81
33. 62 ±0.48
1.4
别为108、106、104(：(^63/此，每1周1次反应，进行 3次。检测结果见表4。其中T G E V 组内重复试验 C V 值在0.10%〜1.02%之间，组间重复试验C V 值 在0.17%〜3.4%之间；P E D V 组内重复试验C V 值 在0.47%〜1.53%之间，组间重复试验C V 值在 0.07%〜1.31 %之间；P o R V 组内重复试验C V 值在 0.42%〜0.83%之间，组间重复试验/值在0.36% 〜1.43%之间，都小于5%，说明这3种病毒的单重 荧光定量R T -P C R 重复性好。
2.1.6 单重荧光R T -P C R 与普通R T -P C R 检测方
法的比较单重荧光R T -P C R 最低检测限可达到 100数量级，灵敏度远远高于普通R T -P C R 。在对病 料进行检测时，传统P C R 方法有漏检5份疑似病 样，从荧光P C R 角度来看，这5份疑似病样C ，值都 处于30〜35之间，应该是病毒含量较少，可见荧光 R T -P C R 灵敏度远远高于普通R T -P C R 。2.2 多重荧光RT -P C R 方法的建立
2.2.1多重荧光定量R T -P C R 反应体系的优化多 重优化时，质粒模板浓度选为1〇8 copies/n L ，结
果 显示，F /R 为 0.5 M U P 为 1.2 值为 58 °C 时，
得到的扩增曲线最佳。
最终确定的多重荧光R T -P C R 反应体系为25 y L : 2Xbuffer 12.5 p L ,F 0.5 m L ，R 0_5 m L ，P 1.2 质
粒模板2 h U 蒸馏水补足至25 n L 。反应条件：95 °C
30 s ;95 °C 5 s ;60 °C 34 s ，40 个循环。
2.2.2多重荧光定量R T -P C R 标准曲线的绘制用 10倍系列稀释的质粒标准品为模板进行多重荧光 R T -P C R 的标准曲线绘制，得出检测T G E V 、P E D V 和 P o R V 三个通道荧光定量R T -P C R 具有较好的线性 关系。其中，T G E V 标准曲线：相关系数/?=0.993，扩
增效率E =0.77;P E D V 标准曲线：相关系数茫=0.989，扩 增效率£=1.16;P o R V 标准曲线：相关系数硭=0.985，扩 增效率£=0.95，见图2。
2.2.3多重荧光定量R T -P C R 特异性试验结果 显示，P R V 、P C V 1、P R R S V 和空白对照在反应过程中 均检测不到荧光信号，其中各个通道均检测到2个 荧光信号，分别为T G E V 和混样中T G E
V ，P E D V 和 混样中P E D V 以及P o R V 和混样中的P o R V 。证明了 多重荧光定量P C R 具有良好的特异性，见图3。2.2.4 多重荧光定量R T -P C R 敏感性试验经过 检测，确定多重荧光定量R T -P C R 针对T G E V 的最 低检出限为2.49 copies/p L ，针对P E D V 的最低检 出限为4.36 copies/ y L ，针对P o R V 的最低检出限 为 4.96 copies/
2.2.5多重荧光定量R T -P C R 重复性试验多重 荧光定量R T -P C R 组内重复试验所用模板的浓度 分别为1〇8、1〇6、1〇4 copies/h L ，每孔同一条件下单独 重复3次；组间重复性试验所用模板的浓度分别为 10'106、10'1 copies/n L ，每 1 周 1 次反应，进行 3 次。 检测结果见表5，其中T G E V 组内重复试验C V 值在
