２０１８年㊀第１３卷第５期ꎬ７６￣８６
生态毒理学报
Asian Journal of Ecotoxicology
V ol.13,2018No.576￣86
㊀㊀基金项目：国家重大 水专项 课题(2017ZX07602￣002,2018ZX07208￣002)
㊀㊀作者简介：孙晶莹(1992￣)ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为分子生态学ꎬE ￣mail: ꎻ㊀㊀*通讯作者(Corresponding author )ꎬE ￣mail:zhangxw@
DOI :10.7524/AJE.1673￣5897.20180108001
孙晶莹，杨江华，张效伟.环境DNA(eDNA)宏条形码技术对枝角类浮游动物物种鉴定及其生物量监测研究[J].生态毒理学报ꎬ2018,13(5):76￣86Sun J Y ,Yang J H,Zhang X W.Identification and biomass monitoring of zooplankton Cladocera species with eDNA Metabarcoding Technology [J].Asi ￣an Journal of Ecotoxicology,2018,13(5):76￣86(in Chine)
环境ＤＮＡ(ｅＤＮＡ)宏条形码技术对枝角类浮游动物物种鉴定及其生物量监测研究
孙晶莹ꎬ杨江华ꎬ张效伟*
污染控制与资源化研究国家重点实验室ꎬ南京大学环境学院ꎬ南京210023收稿日期:2018￣01￣08㊀㊀录用日期:2018￣02￣28
摘要：环境DNA(eDNA)宏条形码(Metabarcoding)技术越来越多地被应用于环境中物种定性识别ꎬ但如何定量监测物种在环境中的丰度尚未得到解决ꎮ本研究以太湖流域常见的5种浮游动物拟同形溞㊁大型溞㊁蚤状溞㊁多刺裸腹溞㊁老年低额溞为研究对象ꎬ建立了一种基于eDNA 宏条形码技术的物种定量方法ꎬ并与实时荧光定量PCR(qPCR)相比较ꎬ研究了eDNA 宏条形码技术多物种定量的准确性ꎮ结果表明ꎬPCR 引物对eDNA 宏条形码的物种检测和定量影响显著ꎮ313bp COI 313引物对浮游动物物种覆盖度高ꎬ但是物种间DNA 扩增的偏好性大ꎬ不适用于eDNA 宏条形码定量检测ꎮ基于COI 序列重新设计的短COI 116引物能够同时检测出所有5个物种ꎮ荧光定量PCR(qPCR)物种拷贝数与物种相对占比呈正相关ꎮeDNA 宏条形码所检出每个物种的序列数与qPCR 定量拷贝数高度一致ꎮ综上ꎬeDNA 宏条形码技术可实现对浮游动物物种的半定量检测ꎬ在生物多样性监测和生物完整性评价有显著的应用价值ꎮ
关键词:eDNA 宏条形码ꎻ生物多样性ꎻqPCR ꎻ引物偏好ꎻ生物完整性ꎻ物种丰度ꎻ相对丰度文章编号:1673￣5897(2018)5￣076￣11㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:A
ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｍａｓｓＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇｏｆＺｏｏｐｌａｎｋｔｏｎＣｌａｄｏｃｅｒａＳｐｅｃｉｅｓｗｉｔｈｅＤＮＡＭｅｔａｂａｒｃｏｄｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Sun Jingying,Yang Jianghua,Zhang Xiaowei *
State Key Laboratory of Pollution Control &Resource Reu,School of the Environment,Nanjing University,Nanjing 210023,China
Ｒｅｃｅｉｖｅｄ8January 2018㊀㊀ａｃｃｅｐｔｅｄ28February 2018
Ａｂｓｔｒａｃｔ:Environmental DNA (eDNA)metabarcoding technology has been increasingly applied to qualitative i ￣dentification of species.However,how to quantitatively monitor different species in the environment has not yet been solved.Here 5common zooplankton species in the Lake Tai basin,including Daphnia magna,Daphnia
similoides,Daphnia pulex,Moina macrocopa,Simocephalus vetulus,were ud to develop a quantitative monito ￣ring protocol.The accuracy of multi ￣species eDNA quantification of eDNA metabarcoding of two primer ts were validated by Real ￣time quantitative PCR (qPCR)methods.P
CR primers significantly affected the species detection and quantification by eDNA metabarcoding.Although the COI 313primer has high coverage of zooplankton species,it is not suitable for eDNA metabarcoding due to the bias of DNA amplification among species.The COI 116primer
第5期孙晶莹等：环境DNA(eDNA)宏条形码技术对枝角类浮游动物物种鉴定及其生物量监测研究７７
㊀designed in this rearch was able to detect all5species simultaneously.The DNA copy numbers and count num￣bers of each species were positively correlated in the qPCR quantification.In eDNA metabarcoding,the reads num￣ber of each species incread with its relative proportion of morphological abundance,which was consistent with the results of qPCR.Therefore,eDNA metabarcoding provides a mi￣quantitative detection of zooplankton with suitable primers,which is valuable in the monitoring of zooplankton biodiversity and biological asssment.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:eDNA metabarcoding;biodiversity;qPCR;primer bias;biological integrity;species abundance;relative abundance
㊀㊀随着高通量测序技术的发展ꎬ基于环境DNA (eDNA)序列解析混合样本或环境介质物种组成的eDNA宏条形码(eDNA Metabarcoding)技术[1]被逐渐应用于生物学的各个领域ꎬ如微生物多样性分析
㊁罕见种和入侵物种监测㊁浮游植物[2]㊁水生动植物生物多样性分析㊁食物网结构重建等[3￣5]研究ꎮ目前ꎬeD￣NA宏条形码研究多集中在物种识别和物种多样性分析ꎬ关于其对物种定量关系的研究相对较少ꎬ这也为该技术在实际环境监测中的应用带来困难ꎮ浮游动物是水生生态系统重要的组成部分ꎬ作为生物标志物能很好地指示水环境质量[6￣7]ꎬ如龟甲轮虫(Keratella sp.)㊁臂尾轮虫(Brachionus sp.)㊁秀体溞(Diaphanosoma sp.)㊁拟裸腹溞(Moinodaphnia sp.)等可以作为水体富营养化的指示生物[7]ꎮ2017年ꎬ有研究首次建立了太湖流域浮游动物条形码数据库[8]ꎬ并开发了基于eDNA的物种识别和高通量生物监测技术用于太湖流域浮游动物多样性研究ꎬ而且发现eDNA宏条形码技术能够显著提高浮游动物物种识别能力和简化浮游动物多样性分析[4,9￣14]ꎮ尽管这上述研究发现浮游动物生物量与序列数之间存在一定线性关系ꎬ并提出可用物种序列数评估物种丰度ꎬ但在eDNA宏条形码技术对物种定量的准确性方面并未做深入探讨ꎬ浮游动物eDNA宏条形码技术的定量体系仍然不够完善ꎮ
表１㊀物种定量方法比较
Table1㊀Comparison of species quantitative methods
定量方法Quantitative methods 定量PCR
qPCR
传统形态学
Traditional morphology
eDNA宏条形码
eDNA metabarcoding
单位Units DNA拷贝数
DNA copies
丰度㊁密度㊁生物量
Abundance,Density,Biomass
DNA量㊁近似生物量
DNA concentration,Inferred biomass
时间成本Time costs
低
Low
高
High
低
Low
人工成本Labor costs
中
Medium
高
High
低
Low
应用Application
用于定量评估特定目标
物种DNA浓度的变化ꎬ
常用于不同样品间相同物种的比较
Ud for quantitatively evaluating the change of
DNA concentration of specific target species,
commonly ud in the comparison of the same
species among different samples
传统的生态调查ꎬ
同一样品中不同物种的比较
Traditional ecological surveys,
comparison of different species
in the same sample
基于eDNA的生态调查ꎬ同时进行
不同样品中相同物种的比较和同一
样品中不同物种的比较研究
Bad on the ecological investigation
of eDNA,the comparison of the
same species in different samples and
the comparison of different species in
the same sample
优点Advantage 可以进行基因拷贝数的绝对定量
Absolute quantitation of gene
copy number can be performed
金钱成本低ꎬ相关设备简单
Low costs,simple equipment required
高通量ꎬ信息丰富
High throughput,imformative
不足Disadvantage 通量较低ꎬ需要依赖标准曲线
Low throughput,relying on
the standard curve
定量过程未考虑个体差异ꎬ需要丰富的
物种鉴定经验ꎬ耗时耗力
Quantitative process does not
consider individual differences,need
rich experience in species identification,
time￣consuming and labor￣intensive
定量体系尚不完善
Quantitative system
is not perfect
７８㊀生态毒理学报第13卷
㊀㊀传统水生生物学研究中ꎬ大多通过人工鉴别物种多样性和生物量来反映物种丰度ꎮ尽管传统定量方法简单ꎬ但其未考虑物种个体差异ꎬ并且需要专业的物种鉴定人员㊁耗时耗力[9￣10]ꎮeDNA宏条形码是对eDNA的特定区域进行扩增ꎬ通过高通量测序进行序列识别[15]ꎬ其基本检测单位为eDNA[16]ꎬ这
与传统以生物个体数为直接观测单位进行定量分析差异巨大ꎬ如何采用eDNA定量监测不同物种的丰度问题尚未得到彻底解决ꎮ虽然eDNA宏条形码和荧光定量PCR(Quantitative PCR,qPCR)[17￣18]均通过检测物种DNA浓度反映物种多度ꎬ充分考虑了物种个体差异(尤其是幼体和成体的区别)ꎬ理论上提供了更加准确的物种定量结果ꎬ但是eDNA宏条形码多采用通用引物扩增环境中的多个物种ꎬ并在PCR 循环结束后进行集中测序ꎬ没有对PCR过程进行连续检测ꎬ其定量结果的可靠性还有待研究(表1)ꎮeDNA宏条形码技术定量研究的缺乏ꎬ也极大的限制了该技术在实际环境监测中的应用ꎮ
本研究以太湖流域常见浮游动物拟同形溞(Daphnia similoides)㊁大型溞(Daphnia magna)㊁蚤状溞(Daphnia pulex)㊁多刺裸腹溞(Moina macrocopa)㊁老年低额溞(Simocephalus vetulus)为研究对象ꎬ通过浮游动物不同个体数混合和研究qPCR和eDNA宏条形码技术对浮游动物定量准确性ꎬ提出基于eD￣NA宏条形码技术的浮游动物物种定量体系ꎮ主要分以下四方面进行研究:(1)eDNA宏条形码通用引物和qPCR物种特异性引物设计和选择ꎻ(2)qPCR 物种定量标准方法构建ꎻ(3)用eDNA宏条形码方法定量物种相对丰度验证ꎻ(4)eDNA宏条形码物种相对丰度定量与qPCR物种定量结果的比较ꎮ
１㊀材料与方法(Ｍａｔｅｒｉａｌｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｓ)１.１㊀实验对象
实验采用的5种浮游动物ꎬ大型溞(D.mag￣na)㊁拟同形溞(D.similoides)㊁蚤状溞(D.pulex)㊁多刺裸腹溞(M.macrocopa)㊁老年低额溞(S.vetulus)分离自太湖流域ꎬ并在实验室驯化培养超过1年ꎬ培养于pH
为7.8~8.3的曝气水中ꎬ每周换水3次ꎬ投喂密度为6ˑ106~8ˑ106cells mL￣1的斜生栅藻ꎮ食物培养方法：在灭菌的BG11培养液中接入斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)ꎬ曝气培养3~4dꎬ离心浓缩ꎮ
表２㊀ｑＰＣＲ引物设计Table2㊀The primer for qPCR
序号No.
引物名称
Primer name
序列(5'￣3')
Sequence(5 ￣3 )
长度/bp
Length/bp
Tm/ħ
1COI.DM.F GGGCCTCCGTTGACTTAAGCATTT
COI.DM.R AGTAAGAGTGCGGTGATTCCAACC
16660
2COI.DP.F AGCAGTGGGTATCACCGCCTTA
COI.DP.R CCACCAGCGGGATCAAAGAAAGAT
11759.6
3COI.DS.F CCCAGATATGGCTTTCCCTCGTT
COI.DS.R CAGCATGAGCAATTCCAGCAGAT
15258.3
4COI.M.F TGGAATCACTGCGCTTCTCCTT
COI.M.R CCTCCGGCTGGGTCAAAGAAAG
11159
5COI.SV.F CGGAACTTGGTCAATCAGGGAGT
COI.SV.R GCTCCTCTTTCTACTGCTCCTCCT
25059
6COI116.F TTAGGRGCHCCWGAYATRGCTT
COI116.R GCRTGRGCRATHCCHGCWGA
11652
7Folmer.F GGTCAACAAATCATAAAGAYATYGG
Folmer.R TAAACTTCAGGGTGACCAAARAAYCA
65850
8COI313.F GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
COI313.R TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
31346
9M13.F GTAAAACGACGGCCAGT
M13.R CAGGAAACAGCTATGAC
22255
注：物种特异性引物名称对应物种ꎬ即大型溞ꎬCOI.DMꎻ蚤状溞ꎬCOI.DPꎻ拟同形溞ꎬCOI.DSꎻ多刺裸腹溞ꎬCOI.Mꎻ老年低额溞ꎬCOI.SVꎮTm表示引物退火温度ꎮ
Note:species￣specific primers correspond to species names.Daphnia magna,COI.DM;Daphnia pulex,COI.DP;Daphnia similoides,COI.DS;Moina macrocopa,COI.M;Simocephalus vetulus,COI.SV.Tm stands for melting temperature.
第5期孙晶莹等：环境DNA(eDNA)宏条形码技术对枝角类浮游动物物种鉴定及其生物量监测研究７９
㊀
图１㊀ｅＤＮＡ宏条形码技术对浮游动物物种定量检测
Fig.1㊀Quantitative monitoring of zooplankton species with eDNA metabarcoding technology
１.２㊀研究方法
利用通用Folmer 引物[19]扩增出大型溞㊁蚤状
溞㊁多刺裸腹溞㊁老年低额溞㊁拟同形溞COI 片段ꎬ并将PCR 产物克隆到pEASY ®￣T3(TransGen Bio ￣tech)中ꎬ构建qPCR 标准质粒ꎮ同时利用COI 片段设计qPCR 特异性引物和eDNA 宏条形码通用引物(表2)ꎮ5种枝角类分别按照固定个体数量混合ꎬ然后分别用qPCR 和eDNA 宏条形码技术进行物种定量分析(图1)ꎮ
１.２.１㊀单物种DNA 提取使用E.A.N.A.®Tissue DNA Kit(OMEGA)试剂
盒提取单物种DNA ꎬ具体操作如下：用无菌无酶吸管挑取10只生物个体ꎬ将水吸干ꎬ加入200μL TL Buffer ㊁25μL OB Protea Solution 涡旋混匀ꎬ55ħ水浴裂解约3h ꎬ每20~30min 拿出涡旋ꎻ13000ˑg
离心5min 取上清ꎻ加220μL BL Buffer 涡旋混匀ꎬ70ħ孵育10min ꎻ加220μL 无水乙醇后过HiBind ®DNA Mini 柱富集DNA ꎻ分别加500μL HBC Buffer 和700μL DNA Wash Buffer 清洗DNA ꎬ重复2次后用100μL Elution Buffer 洗脱ꎻ用Qubit 2.0测定DNA 浓度ꎮ
１.２.２㊀混合物种DNA 提取
5种枝角类按照表3进行混合ꎬ共7个处理组ꎬ
大型溞㊁蚤状溞㊁多刺裸腹溞㊁老年低额溞在每个处理组间生物个体数不变ꎬ均为5只ꎬ拟同形溞在7个处理组间不断增加1~320只ꎬ每个处理组设置3个重复ꎮ
混合浮游动物使用MO BIO PowerWater ®DNA Isolation Kit (QIGEN)进行DNA 提取ꎮ具体操作如下：将滤膜放入5mL PowerWater ®Bead 离心管中加
８０㊀生态毒理学报第13卷
1mL55ħ预热的裂解液ꎬ用MO BIO V otex Adapter 13000￣V1￣15混匀裂解10minꎬ离心取上清ꎮ后续提取步骤与单物种提DNA方法相似：去杂质ꎬ清洗DNAꎬ洗脱ꎮ用Qubit2.0(Thermo Fisher Scientific, USA)进行DNA浓度测定ꎮ
１.２.３㊀引物设计
用Folmer引物[19￣20](表2)分别对5个不同枝角类物种的DNA进行线粒体COI区域扩增ꎬPCR扩增体系：总体积50μLꎬ包含Transtaq SuperMix
(TransGen Biotech)25μLꎬddH
2
O21μLꎬ上下游引物各1μLꎬDNA模板2μLꎻ扩增条件:94ħ预变性2minꎬ94ħ变性30sꎬ50ħ退火30sꎬ72ħ延伸60 sꎮ用1.5%的琼脂糖凝胶进行条带检测ꎬ用MicroE￣lute DNA Clean Up Kit(OMEGA)纯化ꎬ纯化产物进行Sanger测序(南京金斯瑞)ꎬ获得5个物种的标准COI片段ꎮ用Primer premier6设计物种qPCR特异性引物(表2)ꎬ每对引物均获得单一清晰的特异性条带ꎮ使用VECTOR NTI软件进行序列比对ꎬ根据兼并引物设计原则进行通用引物设计(表2)ꎮ１.２.４㊀浮游动物实时荧光qPCR定量
将Folmer引物扩增的5个物种标准COI片段的特异性序列导入pEASY®￣T3载体ꎬ构建5个物种标准质粒ꎮ操作步骤：将准备好的PCR产物和T3克隆载体轻轻混匀后置于冰上进行载体连接约5~10minꎻ然后将插入标准COI片段的T3载体导入Trans￣T1感受态细胞ꎬ轻弹混匀冰浴进行转化ꎻ均匀涂布在LB培养基板上ꎬ过夜培养ꎮ挑选阳性克隆到50mL无菌LB培养基中摇菌6hꎬEasyPure Plasmid MiniPrep Kit(TransGen Biotech)提取质粒DNAꎬ分别用物种特异性引物和M13引物(表2)扩增检测ꎮ用Qubit2.0进行质粒DNA定量ꎬ每个物种的标准质粒按10倍间隔向下稀释5个数量级ꎮqPCR(三步法)实验反应体系20μL:TranStart Top Green qPCR Supermix(TransGen Biotech)10
μLꎬddH2O7.8μLꎬCOI特异性引物0.4μLꎬDNA模板1μLꎬPassive Reference Dye0.4μLꎻ反应条件:94ħ
预变性30sꎬ40个循环(94ħ变性5sꎬ60ħ退火15sꎬ72ħ延伸10s)ꎬ信号采集设置在退火步骤ꎬ采集时间31sꎮ
根据DNA浓度及计算公式计算标准质粒DNA 拷贝数(见1.4)ꎮ将稀释的5个质粒DNA样品所得
C
T
值与标准质粒转化后拷贝数(log10转化)构建标准曲线ꎬ计算每个样品拷贝数ꎬ每个样品3个重复ꎮ１.２.５㊀eDNA宏条形码分析
在通用引物前加上8个碱基短序列来区分不同处理组(表4)ꎮPCR反应体系共50μLꎬ包括Phu￣
sion酶0.5μLꎬddH
2
O31.5μLꎬHF Buffer10μLꎬ10 mmol L￣1dNTP1μLꎬ上游引物1μLꎬ下游引物1μLꎬDNA模板2μLꎮ扩增条件:98ħ预变性30sꎬ35个循环反应ꎬ98ħ变性10sꎬ55ħ退火30sꎬ72ħ延伸10sꎮ使用1.5%琼脂糖凝胶电
泳检测条带ꎬE.Z.N.A.TM E￣Z96ˑ5Cycle￣Pure Kit(OMEGA)试剂盒纯化样品ꎬQubit2.0进行DNA浓度检测ꎬ各样品按50ng等量混合构建DNA文库ꎮ取混合DNA 100μL再一次纯化(Agencourt AMPure XP kit,Bec￣man Coulter)ꎬ用Ion Plus Fragment Library Kit(Life Technoloiges)试剂盒构建DNA文库ꎬAgilent2100检测DNA文库质量ꎬ稀释DNA文库至100pmol L￣1用Ion torrent OT2200Kit(Life Technoloiges)试剂盒将测序文库连接到Ion Sphere Particles(ISPs)表面ꎬ用Ion torrent PGM(Life Technoloiges,USA)测序仪进行测序ꎮ
表３㊀混合样品中物种个体数和拟同形溞占比
Table3㊀The number of species in multi￣species samples and the proportion of Daphnia similoides
处理组Treatment
大型溞
D.magna
蚤状溞
D.pulex
多刺裸腹溞
M.macrocopa
老年低额溞
S.vetulus
拟同形溞
D.similoides
拟同形溞/%
D.similoides/%
DR155551 4.76 DR25555520.00 DR355551033.33 DR455552050.00 DR555554066.67 DR655558080.00 DR7555532094.12
