DOI：10.13822/jki.hxsj.2021007863化学试剂,2021,43(4),488-493
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［分析与测试i
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dde是什么意思高效液相色谱法测定小麦粉及面粉处理剂中
三聚硫氟酸三钠盐的含量
周霞，国振，赵博，赵光亮，张庆合，李秀琴
*
（中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所，北京100029）
摘要：建立了小麦粉及面粉处理剂中三聚硫氤酸三钠盐的高效液相色谱（HPLC）检测方法。对比了不同提取试剂及提取方式对三聚硫氤酸三钠盐回收率的影响，并考察了=聚硫氤酸三钠盐在样品提取液中的稳定性。在最优实验条件下，三聚硫氤酸三钠盐在浓度0.05-2.0p,g/mL范围内线性良好，相关系数R2=1.
0000，方法检出限为0.4mg/kg，定量限为1.0mg/kg。小麦粉中三聚硫氧酸三钠盐的加标回收率为80.4%~84.8%,RSD为1.4%~3.1%；面粉处理剂中三聚硫魚酸三钠盐的加标回收率为87.9%~91.5%,RSD为2.2%~3.2%。
关键词：小麦粉；面粉处理剂；三聚硫報酸三钠盐；高效液相色谱
中图分类号:0652.1文献标识码：A文章编号:0258-3283（2021）04-0488-06
Determination of Trithiocyanuric Acid Trisodium Salt in Wheat Flour and Flour Treatment Agent by High Performance Liquid Chromatography ZHOU Xia,GUO Zhen,ZHAO Bo,ZHAO Guang-liang,ZHANG Qing-he,LI Xiu-qin*(Division of Chemical Metrology and Analytical Science,National Institute of Metrology,Beijing100029,China),Huaxue Shiji,2021,43(4), 488-493
Abstract:A method for the determination of trithiocyanuric acid trisodium salt(TMT)in wheat flour and flour treatment agent was established bad on high performance liquid chromatography(HPLC).The effects of different extraction reagents and extraction methods on the recovery of TMT were compared,and the stability of TMT in the sample extract was investigated.Under the optimal experimental conditions,a wide linearity range(0.05~2.0pig/mL)was obtained with a correlation coefficient R~=1.0000. The detection limit of the method was0.4mg/kg,and the quantitation limit was
1.0mg/kg.The recovery of TMT from wheat flour was in the range of80.4%〜84.8%with RSD being1.4%~3.1%；the recovery of TMT from flour treatment agent was in the range of87.9%~91.5%,with RSD being2.2%〜3.2%.
Key words:wheat flour；flour treatment agent；trithiocyanuric acid trisodium salt(TMT)；high performance liquid chromatography (HPLC)
随着食品工业快速发展，国人生活水平不断提高，对食物多样化的需求也越来越高，食品添加剂已经成为食品加工中不可缺少的原料之一。目前，我国小麦粉行业广泛使用的相关食品添加剂可分为3类：增白剂、营养强化剂和品质改良剂（增筋剂、减筋剂、酶制剂、增稠剂等）。市场上所用的面粉处理剂主要有馒头粉改良剂、面条粉改良剂、水饺粉改良剂、面包粉改良剂及复配面粉处理剂等2010年以前，我国允许使用的小麦粉增白剂为过氧化苯甲酰、过氧化钙、二氧化氯、氮的氧化物⑷。其中被企业广泛使用的是过氧化苯甲酰，由于有研究表明，长期食用过氧化苯甲酰可能会引起慢性苯中毒且具有致癌风险：'•"，从2011年5月1日起禁止在小麦粉中添加增白剂。偶氮甲酰胺因其对小麦粉有增白、增筋和促进成熟的作用，被广泛用作小麦粉品质改良剂，在小麦粉中的最大使用量为45mg/kg®。研究表明，偶氮甲酰胺在烘焙加工过程中能够转变成氨基脓，存在致癌风险⑻。为规范生产行为，加强小麦粉
收稿日期：2020-09-08；网络首发日期:2021-01-25
基金项目：中国计量科学研究院基本业务费项目（AKY1924和AKY1956）。
作者简介：周霞（1991-），女，山东济宁人，博士，助理研究
员，主要从事食品中有害成分分析研究。
通讯作者：李秀琴，E-mail:lixq@nim.ac
引用本文：周霞，国振，赵博.等•高效液相色谱法测定小麦
粉及面粉处理剂中二聚硫氤酸三钠盐的含量［J］.化学试剂.2021,43（4）：488-493o
栀子属
质量安全监管，总局关于进一步加强小麦粉质量
安全监管公告（2017年第132号）指出，严禁生产企业在小麦粉中添加过氧化苯甲酰、次磷酸钠、硫际、间苯二酚、过硫酸盐、廛二哩、曲酸等非食品
原料⑺。
近年来，市面上出现了在小麦粉或面粉处理剂中违法添加三聚硫氧酸三钠盐，以达到抑制小麦粉醒发、复色、长黑点的作用，具体作用机理尚
不清楚。该化合物不是GB2760—2014（食品安全国家标准食品添加剂使用标准》⑷规定的食品
添加剂，因此亟需建立面粉中新型非法添加剂三聚硫氧酸三钠盐的检测方法。三聚硫氧酸三钠盐，英文名称为1,3,5-Triazine-2,4,6-（\H,3H, 5H）-trithione trisodium salt，简称TMT,CAS号17766-26-6，分子式C3N3Na3S3，分子量243.22。该物质为纯白色结晶体，极易溶于水，分子式如下所示。
S/Na
N^N
Na—S艾N兀-Na
=聚硫氤酸三钠盐（TMT）结构式shinny
Chemical structure formula of TMT
文献调研中仅发现3篇TMT检测技术的相
关报道：1）阴极溶出伏安法间接测定标准溶液
中低于ng/mL水平的TMT，通过285nm处的紫spectre
外吸收监测排放废水的TMT含量，检测限为2|xg/mL[91；2）酸碱电位滴定法测定TMT药剂含量，其原理是根据TMT的三级离解常数，用H2so4溶液为滴定剂，在自动电位滴定仪上分别设定pH9.87、pH 3.62为酸碱滴定的起点和终点，可以测定TMT-15中有效物TMT含量何；3）反相高效液相色谱法测定工艺中间体或原料药中TMT的含量，采用Zorbax Eclipd XDB-C1S 色谱柱，流动相选择0.05%三氟乙酸作为水相，V（乙月青）：*甲醇）=75：25作为有机相，梯度洗脱，检测波长290nm，该方法用于活性药物中间体和过程中间体中TMT含量的常规质量控制分析⑴）。
综上，国内外尚未发现关于食品中TMT检测方法的报道。因此，本文根据TMT化学结构、理化性质以及文献报道，开发了小麦粉和面粉处理剂中TMT的测定方法。考察了不同提取试剂及提取方式对TMT回收率的影响，并监测了样品提取液中TMT的稳定性。该方法专属、准确、灵敏、精密，旨在为食品安全监管提供参考。
1实验部分
1.1主要仪器与试剂
SHIMADZU LC-20AD型高效液相色谱仪（配有二极管阵列检测器，日本Shimadzu公司）；ZORBAX型Eclip plus C“色谱柱（4.6mmx150 mm,5|xm，美国Agilent公司）；PL2002、XP205型天平（瑞士Mettler-Toledo公司）;HS260basic型往复式振荡器（德国IKA公司）；KQ-300VDV型双频数控超声start here
波清洗器（中国昆山舒美公司）；Vortex-Genie型涡旋混合器（美国赛默飞科技公司）；Universal320R型高速冷冻离心机（德国Hettich公司）；GHP滤膜（孔径0.2（j.m，美国Pall 公司）。
四丁基漠化钱（纯度＞99%，美国Acros Organics公司）；甲醇、乙月青（色谱纯，德国Merck 公司）；磷酸氢二®（（NH4）2HPO4，纯度〉98.5%）、磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯）、磷酸（H3PO4，分析纯）（北京化工厂）；三聚硫氧酸三钠盐（TMT，纯度＞98%，上海泰坦科技股份有限公司）。
1.2实验方法
1.2.1标准工作溶液的配制
准确称取10mg（精确至0.01mg）三聚硫氤酸三钠盐标准品，置于100mL容量瓶中，甲醇溶解并摇匀，得到浓度为WO wg/mL的标准储备液。吸取5.0mL标准储备液于50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得到浓度为10jig/mL 标准工作溶液。吸取0.25、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0ml.标准工作液于50mL容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，混匀，得到浓度分别为0.05、0.1、
0.2、0.5、1.0、2.0jig/mL的标准系列工作液。
1.2.2样品提取
称取4g（精确至0.001g）试样置于50mL具塞塑料离心管中，加入20mL甲醇提取溶剂，涡旋3min，振荡10min,6000r/m in高速离心2min，转移上清液，残渣重复提取1次，合并提取液，涡旋混匀后过0.22“m有机相微孔滤膜，弃去2~5滴初滤液，取续滤液作为待测试样液。
1.2.3液相色谱条件
色谱柱:ZORBAX Eclip plus C*色谱柱（4.6 mmx150mm,5|xm）；柱温：35七；进样量:10（iL；检测波长：296nm（扫描波长范围为200-400 nm）；流速：1.0mL/min；流动相：A为20mmol/L
KH2PO4缓冲溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序为0.1~5min:30%B,5~9min:70%B,9〜15min: 30%B o
2结果与讨论
2.1色谱条件的优化
2.1.1色谱柱与流动相的选择
根据TMT的理化性质，本文首先考察了离子交换色谱柱Hypersil SAX（250mm x4.6mm, 5呻）。设定流动相为V（5mmol（NH4）2HPO4缓冲盐体系（pH8.05））：V（乙月青）=5O：5O，等度洗脱条件下，TMT保留时间为35.5min，色谱图见图la o调节流动相比例，即乙睛体积比至70%，保留时间缩短为24.9min，色谱图见图lb。由此可知TMT的峰形变差。
a35.5b24.9
02040600102060 //min r/min
a.V（5mmol（NH4）2HPO4缓冲盐体系（pH8.05））:
V（乙睛）=50：50；b.V（5mmol（NH4）2HPO4缓冲盐
体系（pH8.05））:V（乙睛）=30：70
图1不同流动相体系下TMT在SAX离子
色谱柱上的保留
Figi Retention of TMT on SAX ion chromatographic column under different mobile pha systems
其次，考察了5色谱柱对TMT的保留能力，选择ZORBAX Eclip plus色谱柱（4.6mm x 150mm,5pum）进行实验。由于TMT可以以阴离子形式存在，首先考察了四丁基漠化鞍离子对试剂。流动相为V（5mmol四丁基漠化®（pH
6.3））:V（乙月青）=70：30，等度洗脱条件下，TMT
7.2
048
r/min
a.V（5mmol四丁基漠化钗（pH 6.3））:V（乙睛）=70：30；
b.y（20mmol KH2PO4-H3PO4缓冲溶液（pH 3.7））：
V（甲醇）=70：30
图2不同流动相体系下TMT在C|8色谱柱上的保留Fig.2Retention of TMT on C18column under
different mobile pha systems 保留时间为7.2min，相比于采用离子交换色谱柱时TMT保留时间缩短了17.7min，色谱图见图2a。但该条件下仪器灵敏度较差，仪器检出限为0.2pg/mL。将流动相换为 V（20mmol KH2PO4-H3PO4缓冲溶液（p H3.7））：V（甲醇）=70:30，等度洗脱条件下TMT保留时间为4.3min（见图2b），相比采用离子对试剂缩短了约3min，且该条件下仪器灵敏度更好，检出限可达到0.01»g/mL。
综上，选择ZORBAX Eclip plus色谱柱（4.6mmX150mm,5jxm），流动相体系为V（20 mmol KH2PO4-H3PO4缓冲溶液（pH 3.7））：V（甲醇）=70:30时，TMT保留时间最短，仪器灵敏度最好。为避免在实际样品分析时样品中的低极性干扰物质对TMT测定的影响，在等度洗脱5min 后，将流动相中有机相的比例提高至70%，保持4min，以便洗脱残留在色谱柱上的低极性物质。
2.1.2检测波长的选择
文献［12］报道在pH5~10时,TMT在溶液中占优势的组分依次为c3n3s3h3,c3n3s3h；和C3N3S3H2-，其紫外吸收光谱强度可能随着pH的改变而改变。据此，本文考察了不同酸性pH条件下TMT的紫外吸收光谱，即V（5mmol四丁基漠化鞍（pH6.3））：V（乙睛）=70：30、*20mmol KH2PO4-H3PO4缓冲溶液（pH 3.7））:y（甲醇）= 70：30，实验结果见图3。由图可知，在pH 6.3
b
200'300'400
X/nm
a.V（5mmol四丁基漠化钱（pH 6.3））：叫乙購）=7O：3O；
b.V（20mmol KH2PO4-H3PO4缓冲溶液（pH 3.7））：
V（甲醇）=70：30
图3不同流动相体系下TMT紫外吸收光谱图
Fig.3Ultraviolet absorption spectra of TMT under
different mobile pha
systems
时，TMT有两个最大吸收波长，入”心=284nm,
入”跟=330nm，说明TMT在此pH条件下存在形式复杂，且有可能与四丁基澳化镀形成配位模式。在p
H 3.7时，TMT存在形式比较单一，主要以C3N3S3H3分子形式存在，TMT最大吸收波长A m…=296nm o基于以上结果，本文选择A=296 nm为最大吸收波长。
2.1.3样品溶剂的选择
由于溶液pH值会影响TMT的存在形式，本文考察了不同pH样品溶剂对TMT色谱响应的影响。结果表明，在KH2PO4缓冲盐流动相体系下，样品溶剂pH对TMT响应的影响不显著，说明在该流动相系统下TMT的存在形式比较稳定，因此选择纯甲醇（pH7.16）作为样品溶剂，进样量为10“L时TMT峰形良好，未发现溶剂效应。
ether
2.2提取条件的选择和优化
2.2.1提取溶剂的选择
由于TMT极性较强，极易溶于水，因此本文主要考察甲醇、水、乙睛等极性溶剂作为提取溶剂时的提取效果。首先考察了碱性水溶液（pH12）的提取效果，结果表明此条件下小麦粉中TMT回收率仅为（53.9±7.8）%（n=5），而且水提液中极性内源性杂质干扰较多。对于面粉处理剂，其主要包括食用玉米淀粉、碳酸钙、磷酸三钙、维生素C、a-淀粉酶、木聚糖酶和脂肪酶其中添加了许多无机盐类，水提液中的干扰也相对较大。另外，在一些面粉处理剂中加入碱性水溶液提取时，样品呈凝胶状，无
法进行下一步实验。因此，本文将提取溶剂的考察集中在不同体积比例甲醇水溶液和乙睛水溶液等。考察了甲醇溶液、80%甲醇水溶液、20%甲醇水溶液、80%乙月青水溶液、20%乙月青水溶液、混合液V（5mmol四丁基漠化鞍缓冲溶液）：V（甲醇）=40：60，实验结果见图4a。由图可知，纯甲醇的提取回收率最高、80%甲醇水溶液次之，而加入了四丁基漠化钱离子对试剂的提取液，其提取回收率仅有59.2%。综上，TMT的回收率偏低，可能是由于TMT较容易与小麦粉基体中的无机营养素（尤其金属元素）发生结合，而产生沉淀，不易被提取。考虑到TMT的存在形式受溶液pH值影响较大，本文考察了不同pH甲醇溶液的提取回收率，结果见图4b。由图可知，采用纯甲醇（pH7.16）为提取溶剂时，TMT回收率最高，为69.7%o因此本实验选择纯甲醇作为提取溶剂。
&
、>
宝
叵
60打桩工程
40
20
4.38
5.28
6.23
7.16
8.668.95
涡旋涡旋+震荡涡旋+超声涡旋+震荡+超声
a.提取溶剂；
b.甲醇溶液P H；
c.提取方式；爬山的英文
d.提取溶剂体积及提取次数
图4提取条件对TMT回收率的影响Fig.4Effect of extraction conditions on TMT recovery 2.2.2提取方式的优化
本文考察了不同提取方式对小麦粉中TMT 回收率的影响，即涡旋3min、涡旋3min+震荡10min、涡旋3min+超声10min、涡旋3min+震荡10min+超声10min，实验结果见图4c。由图可知，采取只涡旋的提取方式时，TMT的回收率最低，为6&41%；加入震荡或超声后TMT的回收率有一定的提高；涡旋+震荡+超声的提取方式获得的TMT回收率最高，为72.11%。考虑到时间成本，选择涡旋+震荡的提取方式进行后续实验。2.2.3提取溶剂体积及提取次数的选择在线英文翻译中文
通过提取溶剂及提取方式的考察，发现TMT 的总体提取回收率均较低，故需考察提取溶剂体积和提取次数对于回收率的影响，设定条件为20mL甲醇提取1次；10mL甲醇提取2次; 20mL甲醇提取1次，残渣采用10mL再次提取;
20ml.甲醇提取2次；15mL甲醇提取3次，结果见图4d。由图可知，提取次数的增加及提取溶剂体积的增加均可提高回收率。采用20mL甲醇提取1次时，回收率仅为62.36%，而采用20mL甲醇提取2次时则获得了83.42%的回收率，相比前者提高了21.06%。采用15mL甲醇提取3次的条件下获得的回收率最高，为85.64%，其相比于20mL甲醇提取2次的回收率仅提高2.22%。考虑到增加操作次数会增加实验耗时和提取溶剂用量，最终选择采用20mL甲醇提取2次进行后续实验。
2.3样品提取液的稳定性考察
考虑到小麦粉及面粉处理剂基质的复杂性，本文考察了样品提取液的稳定性，将不同加标水平(1.0,2.0JO.O mg/kg)的小麦粉提取液和面粉处理剂提取液在仪器分析环境下定期检查，比较不同时间点系列样品溶液浓度的变化。结果表明，小麦粉基质溶液至少7d内保持稳定，放置7d的变异系数小于2.0%。而TMT在面粉处理剂中很不稳定，48h后低、中、高浓度TMT的面粉处理剂样品提取液中TMT峰面积分别降低了37.8%,33.6%和27.8%。由于pH会影响TMT 的存在形式，从而影响其在样品提取液中的稳定性，因此本文采取调节pH的方式提高TMT在面粉处理剂提取液中的稳定性。向5mL面粉处理剂提取液中加入10jiL10%磷酸甲醇溶液(P H= 4)，监测TMT的稳定性，结果如图5所示。由图可知，72h内3个加标水平的面粉处理剂样品提取液中TMT较为稳定，对于高浓度(10.0mg/kg)和中浓度(2.0mg/kg)加标样品，其TMT峰面积为原来的95%以上；对于低浓度(1.0mg/kg)加标样品，其TMT峰面积为原来的90%以上。因此，调节面粉处理剂提取液的P H有助于提高
曲线1~3浓度分别为2.0,1.0,10.0mg/kg
图5调节pH值后的面粉处理剂提取液TMT
稳定性监测
Fig.5Monitoring of TMT stability in flour treatment
agent extract after adjusting pH value TMT的稳定性，对于面粉处理剂样品建议设置其提取液pH数值为4左右，然后上样检测，如不能及时检测，应将提取液置于-20T保存。
2.4方法学验证
2.4.1线性范围
将标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准系列工作液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线方程为y=56514.1852x-l058.4078，相关系数R2为1.0000，结果表明在浓度0.05~2.0 pg/mL范围内，TMT在标准系列工作液中呈良好的线性关系。
2.4.2检出限和定量限
选择空白样品，定量添加标准溶液，按照方法中介绍的步骤操作，当所得谱图的信噪比S/NM3时，将此添加量定为检出限；当信噪比S/NM10，将此添加量定为定量限。进样量为10|iL时，小麦粉及面粉处理剂中TMT的检出限为0.4mg/kg，定量限为1-0mg/kg。
2.4.3回收率和精密度
trip是什么意思在空白基质样品中按1.0、2.0、10.0mg/kg 水平进行标样添加，各浓度水平的试验均独立重复操作测
定6次，结果如表1所示。由表可知，小麦粉基质中TMT回收率为80.4%-84.8%，相对标准偏差(RSD)为1.4%~3.1%；面粉处理剂基质中TMT回收率为87.9%-91.5%,RSD为2.2%~3,2%。
表1TMT的加标回收率和精密度结果表
Tab.l Recovery and precision of TMT
(n=6)样品基质加标水平/(mg-kg,)回收率/%RSD/%
1.084.8
2.0
小麦粉 2.080.4 1.4
10.083.6 3.1
1.091.5 3.2
面粉处理剂 2.089.2 2.3
10.087.9 2.2 2.4.4共同精密度试验
本次共同精密度试验是根据GB/T6379.2-2004《测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法》〔⑷进行设计的，目的在于确定该方法的重复性与再现性的数值。本方法的共同精密度试验由6个协作单位的6个实验室对TMT 进行加标回收率测定，每个实验室对每个加标水
