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㊀2020Vol.46No.24(Total 420)
连锁店英文DOI:10.13995/jki.11-1802/ts.024766
引用格式：邬佳颖，毛丙永，谷佳玉，等.利用水苏糖的肠道细菌的分离鉴定及其利用特性研究[J].食品与发酵工业,2020,46
omd(24):16-23.WU Jiaying,MAO Bingyong,GU Jiayu,et al.Isolation and identification of the intestinal bacteria capable of uti-lizing stachyo and its utilization characteristics[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(24):16-23.
利用水苏糖的肠道细菌的分离鉴定及其利用特性研究
邬佳颖，毛丙永，谷佳玉，崔树茂，张秋香∗
(江南大学食品学院，江苏无锡,214122)
摘㊀要㊀以水苏糖作为唯一碳源，从健康成人粪便中筛选到12株能利用水苏糖的肠道细菌，包括肺炎克雷伯氏菌㊁屎肠球菌㊁粪肠球菌和产气荚膜梭状芽孢杆菌㊂通过测定细菌培养上清液中水苏糖和棉籽糖含量以及产气情况，结合α-半乳糖苷酶活力测定的结果，发现不同菌株对水苏糖的利用方式存在差异㊂基因组草图分析发现，菌株对水苏糖的利用方式可能有2种：以产气荚膜梭状芽孢杆菌为代表，利用msmEFG 转运体转运水苏糖，再由α-半乳糖苷酶和β-呋喃果糖苷酶水解为单糖再利用；以屎肠球菌㊁粪肠球菌为代表，利用msmEFG 转运体转运水苏糖，由α-半乳糖苷酶将其水解为半乳糖和棉籽糖，并将不利用的棉籽糖释放到细胞外㊂该实验结果对水苏糖与人体健康关系的研究具有指导意义㊂
关键词㊀水苏糖；肠道菌;α-半乳糖苷酶；基因组草图
Isolation and identification of the intestinal bacteria capable of utilizing
stachyo and its utilization characteristics WU Jiaying,MAO Bingyong,GU Jiayu,CUI Shumao,ZHANG Qiuxiang ∗
(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)
ABSTRACT ㊀Stachyo was ud as the only carbon source and 12strains of intestinal bacteria we
re isolated from healthy adult feces,which were confirmed to be capable of utilizing stachyo,including Klebsiella pneumoniae ,Enterococcus faecalis ,Enterococcus faecium and Clostridium perfringen s.The strains can u stachyo in different ways according to the content of stachyo and raffino in the bacterial culture supernatant,the gas production,and the α-galactosida activity.Combined with the results of genome analysis,the strains ud stachyo in two possible ways.Some bacteria such as Clostridium perfringen s can intake stachyo by msmEFG transporter,which is then hydrolyzed by α-
galactosida and β-fructofuranosida.Other bacteria such as Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium can intake stachyo by msmEFG transporter,hydrolyze stachyo into a galacto,and relea the unud raffino outside of the cell.This study will be valuable for the further rearch of the rela-tionships between stachyo and human health.
Key words ㊀stachyo;intestinal bacteria;α-galactosida;draft genome
第一作者：本科生(张秋香副教授为通讯作者,E-mail:zhangqx@jiangnan.edu )
㊀㊀基金项目：国家自然科学基金(31972086)；江苏高校品牌专业建设工程项目(PPZY2015A052)
收稿日期:2020-06-16，改回日期:2020-09-01
㊀㊀人体肠道内定植着1014个微生物，包括1000多个种[1]，肠道菌群组成受到基因㊁饮食㊁疾病等多种因素的影响㊂水苏糖天然存在于地黄或大豆中，是一种由半乳糖(α1ң6)半乳糖(α1ң6)葡萄糖(α1ң2β)果糖组成的功能性低聚糖，具有预防龋齿㊁调节肠道菌群㊁缓解便秘㊁保护肝脏等功能[2-4]㊂水苏糖不能被人体消化吸收，会直接进入大肠，有些肠道细菌能利用水苏糖产气[5]，因此摄入过量水苏糖可能会导致胀气等不良反应㊂
目前关于肠道菌利用水苏糖的相关研究较少㊂HAYAKAWA等在1990年研究大豆低聚糖对人类肠道菌群的影响时发现，实验所用的125株肠道细菌中，包括双歧杆菌属㊁乳杆菌属㊁多形杆状菌属㊁光岗菌属㊁巨单胞菌属㊁梭状芽孢杆菌属㊁克雷伯氏菌属在内的7个属的58株菌能够利用水苏糖[6]㊂WAG-NER等[7]发现给大鼠饲喂水苏糖后会产H2，但未研究是哪些菌利用水苏糖产气;ZHONG等[8]发现水苏糖可以促进嗜酸乳杆菌CICC22162的生长；水苏糖与棉籽糖结构类似，从自然发酵的绿桌橄榄中分离到的乳酸菌几乎都能利用棉籽糖，其中81%的菌株也能发酵水苏糖[9]㊂
本实验从健康人粪便中筛选能够利用水苏糖的细菌，并结合培养液上清液中糖的组成㊁菌株产气情况㊁酶活以及基因组草图分析等，研究菌株对水苏糖的利用特性，对于水苏糖与人体健康关系的研究具有一定的指导意义㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀实验试剂
水苏糖，上海源叶生物科技有限公司；棉籽糖，生工生物工程(上海)股份有限公司；酵母提取物㊁胰蛋白胨，英国Oxoid公司㊂
改良肠道微生物培养基(gut microbical culture medium,GMM)：水苏糖8g，胰蛋白胨4g,KH2PO42g，酵母提取物2g,NaCl0.08g,CaCl20.008g,MgSO4㊃7H2O0.002g,FeSO4㊃7H2O0.73mg，吐温-800.5mL, L-半胱氨酸盐酸盐1g,ATCC Trace Mineral Mix10mL, ATCC Vitamin Mix10mL㊂固体培养基在此基础上加入1.5%~2.0%(质量分数)的琼脂粉，并添加15mL
0.5%(质量分数)的溴甲酚紫作为指示剂㊂
1.2㊀利用水苏糖的肠道菌的分离与鉴定
采集2名健康成年人的新鲜粪便样本，并将样本悬浮在0.9%(质量分数)的生理盐水中；梯度稀释，将样品涂布在以水苏糖作为唯一碳源㊁并添加溴甲酚紫指示剂的GMM固体培养基上[10]，置于厌氧工作站37ħ培养24~48h；挑取能使培养基变黄的菌落，转
接到GMM固体培养基上，划线分离㊁纯化菌株，并对菌株进行16S rRNA测序鉴定㊂
1.3㊀细菌培养上清液中水苏糖的高效液相色谱分析
菌株在以水苏糖作为唯一碳源的GMM培养基中37ħ厌氧培养24h，以8000ˑg离心5min收集上清液，采用高效液相色谱仪Water1525测定上清液中水苏糖的含量，外标法定量㊂色谱条件：采用SugarPak1糖柱(300mm,id3.5μm)，柱温85ħ，流动相为纯水，流量为0.4mL/min㊂
1.4㊀细菌利用水苏糖生长的表征
将菌株接种于以水苏糖作为唯一碳源的GMM 培养基中,37ħ厌氧培养，每隔1h取样，测定菌液的pH值和600nm处的吸光度(OD600)㊂同时取1mL 待测菌液于1.5mL离心管以8000ˑg离心5min，收集上清液备用㊂当菌株生长进入稳定期后，停止实验㊂
1.5㊀α-半乳糖苷酶活力测定
α-半乳糖苷酶活力测定主要参照SCALABRINI 等[11]的方法：经8000ˑg离心5min得菌泥和上清液，其中菌泥经柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗涤2次后重悬，与100μL氯仿混合，振荡破碎，制成粗酶液㊂将250μL粗酶液或上清液与对硝基苯α-D-氨基半乳糖苷混合，在37ħ下反应30min，加入0.2mol/L 500μL Na2CO3溶液终止反应，测定420nm下的吸光值㊂菌泥测定结果对应胞内酶活，上清液测定结果对应胞外酶活㊂
酶活定义：在测定条件下,1min释放1μmol的对硝基苯酚所消耗的酶量(mL)为1个酶活力单位㊂1.6㊀产气实验
将菌株以3%的接种量接种于装有倒置杜氏小管的水苏糖GMM培养基中,37ħ厌氧培养24~48h，观察产气情况并记录㊂
1.7㊀基因组草图的测定
将菌株以4%的接种量接种至5mL MRS液体培养基中进行活化，置于厌氧工作站37ħ恒温培养24h㊂活化2次的菌株以4%的接种量接种至装有80mL MRS液体培养基的蓝盖瓶中，置于厌氧工作站培养24~48h㊂之后将菌液以8000ˑg离心10min得到菌泥，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行基因组草图测序㊂
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采用Illumina HiSeq 2000(Illumina Inc USA)[11]
测序平台对送测菌株的基因组进行双末端测序，获得原始数据即大于基因组100倍的PE150测出数据量㊂然后对其碱基质量㊁碱基错误率㊁碱基分布进行质量控制，对低质量reads 和adapter 进行质量剪切，得到高质量的读长数据㊂上述步骤均由上海美吉生物医药科技有限公司完成㊂
使用短序列组装软件SOAPdenovo2进行从头组装[12]，调试不同K-mer 值，选取N50较长和Scaffold 数量较小的K-mer 值进行拼接，同时调节-u㊁-r㊁-R㊁-F
等参数，获得初步组装结果㊂基于reads 的paired-end 和overlap 关系，将reads 对比到contigs 上，获得最终组装结果㊂调用Gap Clor 软件填补contigs 间的内部空白[13]
captioned，过滤500bp 读长以下的结果，获得完整
序列㊂
采用GeneMark1.1[14]
和Glimmer3.02
[15]
软件预
测送测菌株草图序列中的蛋白质编码基因，已默认参数获取开放阅读框(open reading frame,ORF)的相关信息㊂在预测得到的编码基因基础上进行基因的功能注释，将草图基因的蛋白质序列与各大数据库进行对比，保留前5条序列相似性较高的结果，获得相应的功能注释信息，以此初步确定该蛋白序列与数据库中的蛋白质具备相似的功能㊂上述步骤均由上海美吉生物医药科技有限公司完成㊂本实验主要使用的是京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)的数据库，该数据库包括了完整或部分测序基因组的序列㊁细胞生化过程的图解以及酶分子㊁酶反应等信息[16]㊂
1.8㊀SignalP 5.0预测信号肽在SignalP 5.0软件中输入菌株基因片段的氨基酸或核酸序列，选择物种(革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌)后，系统将对其进行信号肽预测㊂结果以图表形式呈现，根据出现Sec 信号肽(Sec /SPI)㊁脂蛋白信号肽(Sec /SPII)㊁Tat 信号肽(Tat /SPI)或无信号肽(other)的概率来确定测试基因片段是否存在信号肽㊂
1.9㊀数据分析
实验中pH 值㊁OD 600㊁糖含量与酶活力的测定均达到目的
为3次平行，结果以平均值ʃ标准差表示，采用Ori-
gin 9.0作图㊂
2㊀结果与分析
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2.1㊀能利用水苏糖的肠道细菌的分离与鉴定
肠道细菌利用水苏糖会产酸，使指示剂变色㊂根据指示剂变色结果，并结合16S rRNA 测序鉴定，从粪便样品中初步鉴定出23株能利用水苏糖的细菌，包括6个属㊁8个种(表1)㊂
表1㊀健康成年人粪便中分离到的能利用水苏糖的细菌Table 1㊀The intestinal bacteria capable of utilizing stachyo isolated from the feces of healthy adults
属
种
初筛菌株克雷伯氏菌属(Klebsiella )肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae )A3,A4,A9,A16肠球菌属(Enterococcus )
粪肠球菌(Enterococcus faecalis )A12,A13,A36,B7,B30,B44,B54,B8H 屎肠球菌(Enterococcus faecium )A6,A22,B8B 鸟肠球菌(Enterococcus avium )
A43,A48梭状芽孢杆菌属(Clostridium )产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens )B1,B15
双歧杆菌属(Bifidobacterium )长双歧杆菌(Bifidobacterium longum )B39埃希氏菌属(Escherichia )大肠杆菌(Escherichia coli )B16,B34链球菌属(Streptococcus )
唾液链球菌(Streptococcus salivarius )
B9
㊀㊀注:A㊁B 代表2份成人粪便样品(下同)
由于实验所使用的水苏糖纯度仅为85%，试剂中含有的其他成分也可能被菌株利用，因此进一步采用高效液相色谱法测定菌株上清液中水苏糖的含量，根据水苏糖的消耗量确定能够利用水苏糖的细菌㊂结果表明，实际能利用水苏糖的细菌有12株，包括3个属㊁4个种，分别为肺炎克雷伯氏菌㊁屎肠球菌㊁粪肠球菌和产气荚膜梭状芽孢杆菌(表2)㊂
表2㊀细菌培养上清液中水苏糖含量的测定单位:g /L
Table 2㊀Determination of stachyo in the supernatant of
bacterial culture
已有文献报道短双歧杆菌㊁发酵乳杆菌㊁罗伊氏乳杆菌㊁肺炎克雷伯氏菌等多种菌株能够利用水苏糖[17-18]，而屎肠球菌㊁粪肠球菌和产气荚膜梭状芽孢杆菌利用水苏糖的研究为首次报道㊂在BARBARA
等[18]的实验中，屎肠球菌并不能利用水苏糖，而本实验成功筛选到多株能够利用水苏糖生长的屎肠球菌(A6㊁A22㊁B8B)㊂
2.2㊀肠道菌在GMM 培养基中的生长曲线
为研究筛选出来的肠道菌对水苏糖的利用情况，从4种菌中各选1株测定其在以水苏糖作为唯一碳
源的GMM培养基中的生长曲线(图1)㊂各菌株以相同的接种量㊁相同的培养条件进行生长，呈现出不同的生长情况㊂肺炎克雷伯氏菌A3生长最快，在3 h左右进入稳定期，培养至5h结束实验；屎肠球菌A6㊁粪肠球菌A13㊁产气荚膜梭状芽孢杆菌B15在培养5h后进入稳定期，培养至8h结束实验㊂进入稳
定期后,4株菌的上清液pH值为4.40~5.40,A6㊁A13和B15的OD600㊀达到1.30以上㊂
A-肺炎克雷伯氏菌A3;B-屎肠球菌A6;C-粪肠球菌A13;D-产气荚膜梭状芽孢杆菌B15
图1㊀菌株在以水苏糖作为唯一碳源的GMM培养基中的生长曲线
abate
Fig.1㊀The growth curves of the strains in GMM medium with stachyo as the sole carbon source 2.3㊀肠道菌培养上清液中水苏糖及棉籽糖含量测定
由图1可知，不同菌株对水苏糖的利用情况不
同㊂采用高效液相色谱跟踪测定菌株培养上清中的
水苏糖和棉籽糖含量，发现所有菌株的上清液中水苏
糖的含量随时间增长而减少(表3㊁表4)，而棉籽糖
含量的变化并不相同㊂其中，屎肠球菌A6和粪肠球
菌A13的棉籽糖含量逐渐增加；而产气荚膜梭状芽
孢杆菌B15上清液中的棉籽糖含量逐渐减少；肺炎
克雷伯氏菌A3生长较快，棉籽糖含量呈现先增加后
减少的趋势(表4)㊂
表3㊀不同时间菌株上清液中残留糖含量单位:%
Table3㊀Residual sugar content in strain supernatant at
different times
菌株
残留水苏糖含量残留棉籽糖含量
2h4h6h8h10h2h4h6h8h10h
屎肠球菌A696.8293.9192.4079.65-106.19174.28175.92187.85-粪肠球菌A1390.1383.1582.6379.14-117.99157.63166.30175.40-产气荚膜梭状芽孢杆菌B1586.5266.2760.1757.20-90.8078.2671.8062.62-㊀㊀注：残留水苏糖含量/%=不同时间水苏糖含量
0h水苏糖含量ˑ100，棉籽糖同理; - 代表菌株生长已结束，未进行后续测定(下同)
表4㊀不同时间肺炎克雷伯氏菌A3上清液中残留糖含量
单位:% Table4㊀Residual sugar content in Klebsiella pneumoniae A3
supernatant at different times
菌株功夫梦主题曲
残留水苏糖含量残留棉籽糖含量
1h2h3h4h5h1h2h3h4h5h 肺炎克雷伯氏菌A383.9083.8680.3779.0378.48101.62163.77152.4392.0290.15 2.4㊀肠道菌α-半乳糖苷酶活力测定
细菌水解水苏糖需要α-半乳糖苷酶，根据酶所处位置(胞外㊁胞内)，可以进一步推断其利用机制㊂选择稳定期的菌株进行酶活测定，由表5可知，肺炎克雷伯氏菌A3具有较高的胞外α-半乳糖苷酶活力，是胞内酶活力的20倍；屎肠球菌A6㊁粪肠球菌A13的胞内酶活力较高，是胞外酶活力的30~40倍；产气荚膜梭状芽孢杆菌B15的胞内酶活力也较胞外酶活力高㊂由此可见，肺炎克雷伯氏菌A3的α-半乳糖苷酶以胞外为主，其余3株菌的α-半乳糖苷酶以胞内为主㊂α-半乳糖苷酶大多存在于细菌细胞内，除肺炎克雷伯氏菌A3外，实验结果基本与报道符合[19-20]㊂
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royaljelly
表5㊀α-半乳糖苷酶酶活力测定
单位:U /L
Table 5㊀Determination of α-galactosida enzyme activity
菌株
胞内酶活力胞外酶活力肺炎克雷伯氏菌A30.004ʃ0.0010.080ʃ0.01屎肠球菌A60.080ʃ0.010.001ʃ0.003粪肠球菌A13
0.046ʃ0.0050.002ʃ0.001产气荚膜梭状芽孢杆菌B15
0.015ʃ0.005
0.002ʃ0.001
2.5㊀菌株利用水苏糖产气情况
水苏糖进入人体后不被小肠消化吸收，可以达到大肠被肠道细菌发酵㊂摄入高剂量的水苏糖，可能会出现肠胃胀气㊁腹泻㊁消化不良等不适反应[21-22]㊂我们对筛选出的12株菌进行了产气实验，实验结果如表6所示,5株菌能够利用水苏糖产气，分别为肺炎克雷伯氏菌A3㊁A4㊁A16㊁屎肠球菌B8和产气荚膜梭状芽孢杆菌B15，而其余7株不能产气㊂其中，产气荚膜梭状芽孢杆菌B15产气最明显，杜氏小管被气泡充满㊂气体的产生能为产气荚膜梭状芽孢杆菌提供一个良好的厌氧环境，有助于它的生长
[23]
㊂
表6㊀不同菌株在以水苏糖作为唯一碳源的GMM 培养基中的
产气情况
Table 6㊀Gas production of different strains in GMM medium with stachyo as the sole carbon source
菌株
产气情况
肺炎克雷伯氏菌A3,A4,A16+粪肠球菌A13,B7,B30,B44,B54-屎肠球菌A6,A22-屎肠球菌B8
+产气荚膜梭状芽孢杆菌A15
+
㊀㊀注: + 表示产气; - 表示不产气
肠道中的气体主要有N 2㊁O 2㊁CO 2㊁H 2㊁CH 4以及各
种痕量气体(如H 2S㊁NO 等)[24]㊂肠道菌发酵糖类产生的气体主要有两种：一是CO 2，由戊糖磷酸途径代谢
6-磷酸葡萄糖产生；二是H 2，由丙酮酸脱羧过程产生㊂丙酮酸脱羧产氢也可分为梭状芽孢杆菌型和肠杆菌型[25]㊂在梭状芽孢杆菌型中，丙酮酸脱羧后形成焦磷酸硫胺素(thiamine pyrohosphate,TPP)-酶复合物，该复合物将电子转移给铁氧还蛋白(ferredoxin,Fd)，还原型的Fd 被氢化酶氧化并产生H 2；
在肠杆菌型中，丙酮酸转化为甲酸，通过甲酸裂解以及Fd 氧化释放CO 2和H 2[26]㊂研究实验菌株产气所涉及的酶系，需要结合基因组数据进行分析㊂2.6㊀基因组草图分析
对屎肠球菌A6㊁粪肠球菌A13㊁产气荚膜梭状芽孢杆菌B15㊁肺炎克雷伯氏菌A3进行基因组草图测序,4株菌的基因组草图数据已经上传至NCBI 的SRA 数据库，结果如表7所示㊂屎肠球菌和粪肠球菌的GC 含量均在38%左右，与文献报道相符[27-28]㊂产气荚膜梭状芽孢杆菌B15的GC 含量约为39%，基因数量最少；肺炎克雷伯氏菌A3在4株菌中GC 含量最高㊂
表7㊀细菌的基因组草图信息
Table 7㊀Bacterial genome sketch information
菌株
基因数量序列大小/Mbp GC 比例/%Scaffold/总数Scaffold N50/
bp 登录号屎肠球菌A65332 4.3738.3718289484SRR12123670粪肠球菌A13
5385 4.5438.57145178993SRR12123705产气荚膜梭状芽孢杆菌B152648 2.1639.1083128544SRR12124348肺炎克雷伯氏菌A3
4731
4.06
59.35
132
198214
SRR12123698
送测基因组草图的菌株中，肺炎克雷伯氏菌A3和产气荚膜梭状芽孢杆菌B15均能利用水苏糖产气㊂已有研究表明，肺炎克雷伯氏菌等兼性厌氧菌在产气过程中，通过丙酮酸甲酸裂解酶将丙酮酸转化为甲酸，再由甲酸裂解酶系统的多酶复合物分解甲酸产氢[29]㊂一般来说，甲酸裂解酶是由甲酸脱氢酶-H㊁氢化酶以及电子载体组成的复合物[30]㊂甲酸裂解酶-H 的大亚基由fdh 基因编码表现出催化性质，而其余部分是由hcyBCDEFG 编码起还原氢分子的作用[31];
hypABCDE 编码合成氢化酶[32];fhlA 作为决定性基因，是中央调节因子[33]㊂肺炎克雷伯氏菌A3的基因组草图数据中能够找到上述相关基因片段(图2)㊂A -氢化酶以及电子载体部分基因片段;B -甲酸脱氢酶-H 大亚基部分基因片段
图2㊀肺炎克雷伯氏菌A3中与产气相关的基因簇
Fig.2㊀Gene clusters related to gas production in Klebsiella pneumoniae A3
注：图谱上箭头的长度和方向分别代表了基因的长度和编码方向；如果出现基因上下错开的情况，说明该基因与上游或下游基因有重叠(下同)
