【热点】研究⾃噬不得不说的关键分⼦
⾃噬是真核细胞维持内环境稳态的⼀种内在平衡机制。⼤量证据表明⾃噬通路在多种疾病与⽣理过程中起着重要作⽤，如：神经系统疾病、肿瘤、⼼⾎管疾病、感染、代谢性疾病、⾃⾝免疫性疾病等等，⾃噬通路也就成为是很多疾病潜在的靶向治疗通路。⼤隅良典因发现细胞⾃噬机制获得2016年度的诺贝尔⽣理学或医学奖。
那么在⾃噬研究中有哪些经典热门靶点呢？今天我们就来说说⼤⾃噬Macroautophagy (也可以简称为⾃噬Autophagy)中的⼀些关键分⼦。
什么是⾃噬？
Autophagy（⾃噬）来⾃于希腊语，是auto=lf和phagy=phagein=to eat的结合。细胞是怎么吃掉⾃⼰（lf-eating）的呢？⼤致是⼀个通过膜将部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋⽩质等组分包裹起来形成⾃噬体，后与溶酶体融合形成⾃噬溶酶体，最终降解其所包裹的内容物的过程。
⾃噬发⽣可以⼤概总结为以下⼏个阶段：
⾃噬泡(phagophore)的发⽣
⾃噬体(autophagosome)的形成
幸运的英文
⾃噬的运输融合(fusion)：⾃噬体与溶酶体融合形成⾃噬溶酶体
⾃噬的降解(degradation)
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topazThe autophagic process. (Michelle Cicchini, et al. 2015)
关键分⼦标志物
⾃噬的整个过程中, 时刻都受到不同的⾃噬相关基因(autophagy-related gene, ATG)的调控, ⼤约已有38个⾃噬相关基因被发现。这些基因在酵母和哺乳动物⾼度保守, 是⾃噬发⽣必不可少的分⼦，参与了⾃噬发⽣的不同阶段。
Atg1(ULK1)蛋⽩激酶复合体
Atg1是第⼀个在酵母中被成功克隆的⾃噬基因，哺乳动物中的同源基因为ULK1 (unc-51-like kina 1)。ULK1是⾃噬泡形成所必需的⼀种蛋⽩，以复合物的形式存在，与⾄少三种蛋⽩质组成复合物：ATG13，FIP200和ATG101。蛋⽩复合物的形成对维持ULK1的稳定性和激酶活性⼗分重要。在存在氨基酸的情况下，mTORC1具有活性并通过磷酸化ULK1和ATG13来抑制⾃噬。⽽当营养物质缺乏时, 溶
酶体表⾯上的mTORC1活性被抑制, ULK1和ATG13快速去磷酸化，导致ULK1激酶的活化并诱导⾃噬发⽣。在营养能量缺乏时, AMPK也可以通过磷酸化ULK1激活其活性, 从⽽进⼀步促进⾃噬。
The ULK1 complex undergoes multiple modifications: phosphorylation (P), acetylation (Ac) and ubiquitylation (Ub). Modifications coloured in green suggest activation, whereas in red inhibition, of the ULK1 complex and autophagy. (Maria Zachari, et al. 2017)
Vps34（PIK3C3）-Beclin1（BECN1）复合物PI3K
Vps34是哺乳动物中的第III类PI3 Kina（PIK3C3），磷酸化磷脂酰肌醇（PI）产⽣磷脂酰肌醇三磷酸（PI3P），这对于⾃噬泡膜的延伸和ATG蛋⽩向⾃噬泡的招募⾄关重要。Vps34因结合Vps15⽽被激活, 并进⼀步结合Beclin-1形成Vps34-Vps15-Beclin1复合物。
Beclin1（BECN1）是酵母Atg6在哺乳动物中的同源基因。由于Beclin1与肿瘤的密切关系，成为了⾃噬与肿瘤关联的重要纽带。Beclin1被ULK1磷酸化，并作为PI3K复合物的整体⽀架，促进⾃噬蛋⽩定位到⾃噬泡。当PI3K复合物与其他不同的调节蛋⽩结合时，选择性地参与⾃噬的不同阶过程，如：与Atg14结合参与⾃噬泡的形成；与UVRAG结合参与⾃噬泡的成熟和运输等。
Phosphatidylinositol 3-kina complex and Phosphatidylinositol 3-phosphate (PI3-P) generation from phosphatidylinositol (PI).
Atg12-Atg5复合物
⾃噬泡的延伸会形成⾃噬体，⼀般为双层膜细胞器。⾃噬发⽣过程中有两个类泛素化修饰过程，分别发⽣在Atg5-Atg12系统和LC3系统中，对于⾃噬泡的延伸与⾃噬体的成熟⾮常重要。
薪酬水平Atg5是参与⾃噬泡中吞噬细胞膜延伸的关键蛋⽩，它与Atg12形成组成型的复合物。在此过程中，⾸先Atg7作为类E1泛素活化酶激活Atg12；然后Atg12被传递给类E2泛素转移酶Atg10；最后Atg12与Atg5结合形成复合物。之后Atg12-Atg5复合物⼜进⼀步与Atg16L结合形成Atg12-Atg5-Atg16L复合物，定位于⾃噬体的外膜上。Atg5-Atg12-Atg16L复合物具有类E3连接酶活性，主要通过激活Atg3酶活性, 促进LC3（也就是Atg8）从Atg3转移到底物磷脂酰⼄醇胺(PE)上。⼀旦⾃噬体形成后，Atg5-Atg12-Atg16L复合物就从膜上解离下来。
LC3-PE复合物
LC3也叫微管相关蛋⽩1轻链3 (microtubule- associated protein1 light chain 3，MAP1LC3)，是Atg8在哺乳动物中的同源物。包括两种可相互转化的形式即LC3-I和LC3-II，参与了⾃噬体膜的形成。Atg4切割早期合成的pro-LC3暴露C端⽢氨酸形成胞浆可溶形式的LC3-I。诱导⾃噬
后，LC3-I在类E1酶Atg7、类E2酶Atg3以及类E3酶Atg5-Atg12-Atg16L复合物的共同作⽤下与⾃噬体
膜表⾯的底物PE偶联，形成膜结合形式的LC3-II。LC3-II是⾃噬体的重要标志分⼦, 随⾃噬体膜的增多⽽增加。
Atg5-Atg12 complex conjugation system and LC3-PE conjugation system. (Jong-Ok Pyo, et al. 2012)
基于LC3的⾃噬流检测⽅法
超微电镜是观察⾃噬现象的最直接的⽅法。不过，超微电镜只能提供静态信息，不能检测⾃噬流，也不能区分⾃噬体的积累是由于⾃噬的诱导还是下游⾃噬过程的阻塞。⽽Atg蛋⽩的免疫印迹分析或免疫荧光染⾊也存在着⽆法检测⾃噬流或不能判断⾃噬改变的原因的局限性。
⽬前⽤于观察⾃噬流变化的主流⽅法是LC3双荧光标记法，即细胞中同时带有RFP和GFP两种不同颜⾊的荧光蛋⽩与LC3蛋⽩融合，从⽽可以实时监测⾃噬体到⾃噬溶酶体的变化过程，监控⾃噬流。其原理是：⾃噬体内腔pH值约为7，⽽溶酶体pH值约为4。⾃噬体与溶酶体融合后，腔室内pH降为4。利⽤GFP在酸性环境中淬灭、RFP则可以稳定发光的特点，来观察细胞⾃噬体的成熟或⾃噬流的变化。
当⾃噬发⽣时，⾃噬体被RFP与GFP同时标记，可见明亮黄⾊光斑（RFP+GFP+）。当⾃噬体成熟、⾃噬体和溶酶体融合时，⾃噬溶酶体内的pH值降低，使GFP荧光淬灭，因此只可观测到红⾊RFP+光
斑，指⽰⾃噬溶酶体。如果⾃噬体与溶酶体可正常融合，那么红⾊RFP+光斑数量⼤于黄⾊RFP+GFP+光斑；如果⾃噬降解受阻，⾃噬体与溶酶体不能正常融合，那么仅黄⾊RFP+GFP+光斑增加，主要为黄⾊荧光。LC3双荧光基因敲⼊⼩⿏可以⽤在体内实时监测⾃噬过程。
Mice express RFP-EGFP-LC3 or mCherry-EGFP-LC3 for measuring autophagy flux. The numbers of GFPC RFPC puncta (yellow) and RFP puncta (red) are counted. Yellow puncta reprent phagophores and autophagosomes, and red puncta reprent autolysosomes.（Akiko Kuma, et al. 2017）
利⽤⾃噬缺陷⼩⿏模型研究⾃噬
对Atg基因敲除⼩⿏的分析有助于理解体内⾃噬的⽣理作⽤。关键Atg基因全⾝性敲除纯合⼦⼩⿏往往是胚胎或新⽣致死的，例如：Becn1-/-⼩⿏在E8.5天死亡，Atg5-/-和Atg7-/-⼩⿏⼤约在出⽣后1天死亡。
可以利⽤条件性Atg基因敲除⼩⿏，在特定组织或特定时期阻断⾃噬的形成。例如：Becn1f/f; Pcp2-Cre在Purkinje细胞中敲除Becn1基因，⽤于研究神经退⾏性病变。Atg7f/f;UBC-CreERT2在他莫昔芬给药后诱导⼴泛性Atg7基因缺失，避免纯合⼦⼩⿏新⽣致死，可⽤于研究成年⼩⿏⾃噬缺失后的病理与⽣理变化，如：神经退⾏性病变或免疫异常等等。
或者可以将Atg基因敲除⼩⿏与组织特异性启动⼦驱动Atg基因表达的转基因⼩⿏交配，在特定
组织中恢复Atg基因的表达，例如：Atg5-/-;Eno2-Atg5在神经元中表达外源Atg5基因，可以挽救Atg5缺失⼩⿏的神经元损伤和新⽣致死，使⼤多数⼩⿏存活8周⾄8个⽉。
南模⽣物可提供成品⼩⿏品系
体育用品 英文品系名称编号供应状态
Becn1-KO NM-KO-18028胚胎
Becn1-CKO NM-CKO-18008胚胎emmanuel>prayer是什么意思
Atg5-KO NM-KO-18004胚胎
Atg5-CKO NM-CKO-00131活体
Atg7-CKO NM-CKO-18006活体
R26-(mCherry-EGFP-LC3)NM-KI-00124活体
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百万英镑英文版参考⽂献
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Zachari M, Ganley IG. The mammalian ULK1 complex and autophagy initiation. Essays Biochem. 2017 Dec 12;61(6):585-596.
短裙英文Pyo JO, Nah J, Jung YK. Molecules and their functions in autophagy. Exp Mol Med. 2012 Feb 29;44(2):73-80.
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