高磷诱导及膦甲酸钠干预血管平滑肌细胞钙化的研究
[摘要] 目的 观察不同浓度磷对体外培养的牛主动脉平滑肌细胞钙沉积及骨钙素表达的影响,同时观察膦甲酸钠对高磷诱导该细胞钙化的干预作用。方法 体外培养牛主动脉平滑肌细胞，观察不同磷浓度（Pi 1.5、2.0mmol·L-1）、不同培养时间（3、6、9d）血管平滑肌细胞的钙沉积，以及不同磷浓度（Pi 1.5、2.0、2.5mmol·L-1）培养血管平滑肌细胞72h骨钙素的表达。同时观察不同浓度膦甲酸钠对高磷（Pi 2.0mmol·L-1）诱导的钙沉积和骨钙素增加的抑制作用。用甲O-酚酞络合酮方法测定钙含量；放射免疫法测定培养上清液中骨钙素的浓度；BCA法测定蛋白含量，用蛋白含量标化钙含量与骨钙素浓度；RT-PCR测定骨钙素mRNA的表达。结果 在相当于正常血磷浓度（1.5mmol·L-1）的培养基中，平滑肌细胞钙沉积量小；而在相当于高磷血症（2.0mmol·L-1）的培养基中，钙沉积明显增加[培养6d，（77.187±11.692）vs（25.768±1.750）μg·（mg蛋白）-1，P＜0.01],并呈时间和剂量依赖性。与Pi 1.5mmol·L-1组相比，Pi 2.0 mmol·L-1组培养上清液中骨钙素的水平明显增高[（1.503×10-2±2.601×10-3）vs（2.981×10-3±8.382×10-4）ng·（μg蛋白）-1，P＜0.001]；Pi 2.0mmol·L-1组平滑肌细胞骨钙素mRNA的表达也明显增加（OC/GAPDH，1.906±0.132 vs 0.748±0.036 6，P＜0.001）。膦甲酸钠能有效地抑制钙沉积[培养6d，Pi 2.
0mmol·L-1+PFA 1.0mmol·L-1组vs Pi 2.0mmol·L-1组，（灵格风37.729±5.899）vs（77.187±11.692）μg·（mg蛋白）-1，P＜0.001]和上清液中骨钙素的表达[（4.529×10-3±1.250×10-3）vs（1.503×10-2±2.601×10-3）ng·（μg蛋白）-1，Ppromis＜0.001]及平滑肌细胞骨钙素mRNA的表达（OC/GAPDH，0.642±0.092 vs 1.885±0.165，P＜0.01）。结论 高磷能直接促进血管平滑肌细胞钙沉积和骨钙素表达的增加，说明高磷血症可能是促进血管钙化的独立危险因素；膦甲酸钠能有效地抑制高磷诱导的血管平滑肌细胞钙沉积和骨钙素表达的增加，可以作为一种新的防治高磷诱导血管钙化的药物。
[关键词]血管平滑肌细胞；磷酸盐；钙化；骨钙素；膦甲酸钠
Study of vascular smooth muscle cell calcification induced by hyperphosphate and intervented by phosphonoformic acid
LU Wei-ping 1，WANG Xiao-yun 2，ZHAO Xiu-fen 2
(1.Department of Endocrinology，the Huaian First Affliated Hospital of Nanjing Medical University，Huaian 223300,China;2.Department of Nephrology，the First Affliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029,China)
Abstract:Objective To evaluate the effects of different concentrations of phosphate on calcium deposition and osteocalcin level in bovine aortic smooth muscle cell cultures and obrve the effects of phosphonoformic acid(PFA)in different concentrations on vascular calcification induced by elevated phosphate.MethodsBovine aortic smooth muscle cells(BASMC)were cultured.Calcium deposition and the expression of osteocalcin in different concentrations of phosphate(1.5 and 2.0mmol·L-1)and PFA were determined by o-cresolphthalein complexone and radioimmunity methods respectively，osteocalcin mRNA expression were determined by RT-PCR.Results After six days of BASMC culture,the calcium deposition in Pi 2.0mmol·L-1 group was more than that in Pi 1.5mmol·L-1 group[(77.187±11.692）vs（25.768±1.750）μg·（mg protein）-1,P＜0.01].The calcium deposition was dependent on time and dosage of phosphate treatment.After 72h culture，the osteocalcin in Pi 2.0mmol·L-1 group was more than that in Pi 1.5mmol·L-1 group [（ 1.503×10-2±2.601×10-3)vs(2.981×10-3±8.382×10-4)ng·(μg protein)-1,P＜0.001),the same as osteocalcin mRNA expression（OC/GAPDH,1.906±0.132 vs 0.748±0.036 6，P＜0.001）.PFA decread ciacium depo
sition[Pi 2.0mmol·L-1+PFA1.0mmol·L-1 group vs Pi 2.0mmol·L-1 group,（37.729±5.899）vs（77.187±11.692）μg·（mg protein）-1，P＜0.001]and osteocalcin expression[(occupy是什么意思 新目标英语4.529×10-3±1.250×10-3)vs(1.503×10-2±2.601×10-3)ng·(μg protein)-1,P＜0.001]statistically,as well as osteocalcin mRNA expression(OC/GAPDH,0.642±0.092 vs 1.885±0.165，P＜0.01).Conclusion Hyperphosphate may directly promote calcium deposition and the osteocalcin expression of BASMCs,it may be a new explanation of the phenomenon on vascular calcification under hyperphosphatemic conditions.Hyperphosphatemia is an independent factor to stimulate vascular calcification.PFA can inhibit calcium deposition and osteocalcin expression induced by elevated phosphate.PFA may be a new medicine to treat vascular calcification induced by elevated phosphate.
Key words:vascular smooth muscle cell；phosphate；calcification；osteocalcin；phosphonoformic acid
（Modern Medical Journal,2008,36:73-77）
终末期肾病(ESRD)接受长期肾替代治疗的患者越来越多，这些患者的一个严重问题是血管病变，包括缺血性心脏病、脑血管病变和动脉粥样硬化，是其主要的死因。ESRD患者（即使是年轻的患者）常存在血管钙化，与病死率呈正相关[1]。肾病特别是ESRD患者常存在高磷血症。近来高磷血症被认为是引起血管钙化和心血管病变死亡的主要危险因素之一[2]。cretary generalKestenbaum等[3]研究发现，高磷血症是导致ESRD患者病死率和心肌梗死发生率升高的危险因素，且独立于肾功能和其他已知危险因素。研究高磷血症致血管钙化的机制及防治措施具有重要的临床意义。本实验观察不同浓度磷对体外培养的牛主动脉平滑肌细胞钙沉积及骨钙素表达的影响，初步探讨高磷血症促进血管钙化的可能机制；同时观察膦甲酸钠（phosphonoformic acid，PFA）对高磷诱导该细胞钙化的干预作用，从而为防治ESRD患者血管钙化提供新的理论观点。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
健康新生小牛胸主动脉由南京血清厂提供，胎牛血清为上海浦东开发区高桥兽医站产品，DMEM、胰蛋白酶为Gibco公司产品，钙测定试剂盒为Sigma公司产品，BCA蛋白测定试剂
为上海吉泰生物技术公司产品，骨钙素放射免疫分析试剂盒购自天津市协和医药科技有限公司，RT-PCR试剂盒为大连宝生物有限公司产品，膦甲酸钠由江苏天晴制药厂提供。细胞培养箱(Queue公司产品， Q2711型)，YJ-875医用净化工作台（苏州净化设备厂），倒置相差显微镜(重庆光学仪器厂，XSZ-D型)，高速、低温离心机（Heeraeus, D-37520型），PCR仪（GeneAmp PCR-system 9600），电泳仪(LKB BROMMOL/LA 2197 power supply)，UVP凝胶密度扫描仪(美国 Gene公司)。
1.2 牛主动脉平滑肌细胞（VSMC）的培养
采用贴壁法原代培养。无菌条件下迅速取出健康新生小牛胸主动脉，置于无菌培养皿中，用D-Hanks液洗净，剥离血管外结缔组织；以眼科剪纵行剖开，小心剥离血管外膜和内膜，然后用眼科剪将血管中膜剪成1mm3大小，接种于100ml培养瓶中，置37℃、体积分数为5%CO 2孵箱中培养3～4h，待其贴壁后加入含有15%胎牛血清、100U·ml-1青霉素、capn100μg·ml-1链霉素的DMEM培养液约4ml，静置于37℃、体积分数为5%CO 2孵箱中继续培养。每周换液2次。一般在接种后7～10d可见平滑肌细胞由组织边缘爬出，光镜下细胞呈贴壁极性生长，高低起伏呈“峰”、“谷”状。待VSMC生长融合时，用0.25%的胰蛋白酶消化、传代培养。
5～6代细胞胰蛋白酶消化后分别接种于6孔培养板，细胞融合后换用正常磷（Pi 1.5mmol·L-1）、高磷（2.0mmol·L-1）培养基培养10d,2组培养基中钙离子浓度为1.8mmol·L-1。同时用Pi1.5mmol·L-1、Pi2.0mmol·L-1usb host及Pi2.0mmol·L-1+PFA（浓度分别为0.25、0.5、1.0mmol·L-1）培养基培养3d,所有培养基中钙离子浓度均为1.8mmol·L-1。换用培养基的第1天定为0天。
1.3 钙沉积定量
培养不同天数的细胞用D-Hanks液洗涤3次后，0.6mol·L-1盐酸脱钙24h。盐酸悬液中钙含量用甲O-酚酞络合酮方法测定。脱钙后的细胞用D-Hanks液洗涤3e mail是什么意思次，0.1mol·L-1NaOH/0.1%SDS溶解细胞，BCA（Bicinchoninic acid）法测定蛋白含量。用蛋白含量标化钙含量。
1.4 骨钙素测定及RT-PCR
第5～6代细胞胰蛋白酶消化后分别接种于6孔培养板及培养瓶，细胞汇合后换用不同磷浓度的培养基:Pi 1.5、Pi2.0、Pi2.5mmol·L-1及Pi2.0mmol·L-1+PFA（浓度分别为0.25、0.5
、1.0mmol·L-1）培养基培养72h。125I放射免疫法测定上清液骨钙素浓度，用蛋白含量标化骨钙素浓度。
RT-PCR法测定骨钙素mRNA的表达：第5～6代细胞胰蛋白酶消化后分别接种于培养瓶，培养72h，磷及PFA浓度同上。根据GenBank数据库bovine osteocalcin mRNA序列，利用Primer Premier引物设计与分析软件设计骨钙素引物,引物序列为：骨钙素上游5′-GGCGCTACCTGGACCACTG-3′， 下游5′-GCCGTAGA AGCGCCGATAG-3′(146bp)；内参照GAPDH上游 5′-TTCCGCGTCCCCACTCCCAAC-3′,下游5′-GTGGCGG AGATGGGGCAGGACT-3′(398bp)。引物委托上海生工生物技术有限公司合成。Trizol法提取总RNA，在20μl反应体系中进行逆转录反应，反应产物用于PCR扩增。变性 94℃，45s；退火55℃，45s；延伸 72℃， 90s;循环35次。PCR产物在2.0%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察，用凝胶扫描系统进行光密度积分扫描，以GAPDH为内标，计算OC/GAPDH光密度积分比值进行定量分析。
1.5 统计学处理
数据以 x-±s表示，用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析，多组均数的比较采用方差分析，
两组均数的比较采用t检验，P＜0.05nbs表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 平滑肌细胞的鉴定
在载玻片上培养的平滑肌细胞生长融合后，用免疫组化法（α-actin、角蛋白）证实为血管平滑肌细胞。
2.2 不同磷浓度培养不同时间对平滑肌细胞钙沉积的影响
见表1。
由表1可见，随着培养时间的延长，Pi 2.0mmol·L-1组平滑肌细胞钙沉积比Pi 1.5mmol·L-1组明显增加（P＜0.01），且呈时间和剂量依赖性。
2.3 PFA对钙沉积的干预作用
见表2。
（P＜0.001），且呈剂量依赖性。
2.3 培养上清液骨钙素浓度的测定
武汉室内设计培训见表3。
由表2可见，随着磷浓度的增高，钙沉积明显增加（P＜0.001）；PFA能有效地减少钙的沉积
