stringTie：转录本组装和定量⼯具
对于转录组数据⽽⾔，最基础的分析就是基因和转录本⽔平的定量了，定量就是确定⼀个基因或者转录本的表达量，其中定量的⽅式有很多种。
最直接的⽅式就是统计mapping到这个基因/转录本上的reads的个数，将reads数作为表达量。我们称这种表达量为raw count。
在raw count的基础上，利⽤外显⼦长度进⾏归⼀化，就得到了TPM值的定量⽅式。对于每个基因，将raw count除了该基因的长度（exon长度之和) , 得到长度归⼀化之后的表达量。某个基因的TPM值就是利⽤归⼀化之后的表达量，计算了⼀个相对丰度。具体计算公式如下，注意基因长度以k为单位
在raw count的基础上，利⽤测序量和外显⼦长度两个因素进⾏归⼀化，就得到了RPKM/FPKM 值的定量⽅式。⾸先将raw count除了mapping 上的所有reads数，得到相对丰度，在除以该基因长度（exon长度之和）, 就可以计算出RPKM值。测试时每⼀条插⼊⽚段称为⼀个fragment，对于双端测序，⼀个fragment 会得到两条reads。
RPKM和FPKM 唯⼀不同的地⽅在于raw count的计算，RPKM 计算的是reads 数，⽽FPKM 值计算的是fragments 数，对于单端测序， fragment 和 reads 的个数是相等的；对于双端测
序，reads 数⽬是fragments 数⽬的两倍，对于FPKM ⽽⾔，即使双端的两条reads都⽐对上了基因组，在计数时也知计⼀次，因为两条reads来源于同⼀个fragment。
具体计算公式如下, 需要注意单位，mapping上的reads 总数以M为单位，基因长度以k为单位。
能够进⾏定量的软件有很多，本⽂主要介绍stringTie这款软件。
在早期的转录组数据分析中，最经典的分析策略是tophat+cufflinks+cuffdiff, 这套分析的pipeline 会给出基于FPKM值的定量结果，然后进⾏差异分析，但是随着测序数据量的提⾼和分析⼿段的发展，这套分析策略出现了很多的问题。
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⾸先就是tophat的速度很慢，相⽐新出的⽐对软件，其速度可以算得上是龟速了，同样的数据量，hisat/star只需要半个⼩时就可以⽐对完成，tophat2⾄少需要5到6个⼩时；其次，基于FPKM值得到的差异结果和实验⼿段如qPCR验证的⼀致性较差。
为了顺应测序和分析的新趋势，原本的开发团队对整个pipeline进⾏了全⾯升级, ⽤hisat 代替tophat, ⽤stringTie + ballgown 代替cufflinks + cuffdiff。
stringTie 可以看做是cufflinks 软件的升级版本，其功能和cufflinks是⼀样的，包括下⾯两个主要功能
damn>哈尔滨速记1. 转录本组装
2. 定量
相⽐cuffinks, 其运⾏速度更快。该软件的官⽹如下
primary怎么读ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml化学符号
stringTie的输⼊⽂件为经过排序之后的bam⽂件，常见⽤法有以下⼏种
1. 对已知转录本进⾏定量
对于模式⽣物，如human, mou等，通常只需要对已知的转录本定量即可，⽤法如下stringtie -p 10 -f -f -b ballgown_out_dir -e align.sorted.bam
-G参数指定参考基因组的gtf⽂件，-o指定输出的⽂件，格式也为gtf, -b指定ballgown的输出结果⽬录，这个参数是为了⽅便下游进⾏ballgown差异分析，-e参数要求软件只输出已知转录本的定量结果。新航道英语
在输出的GTF格式的⽂件中，对于每个转录本，会给出以下3种表达量
1. coverage2013北京高考英语
2. TPM
3. FPKM
泰晤士报世界大学排名2. 组装本组装
对于单个样本进⾏组装，⽤法如下
stringtie align.sorted.bam -f -p 20 -f
北京linux培训在组装的转录本中，也会给出定量的结果，对于组装的新转录本和基因，默认采⽤STRG加数字编号进⾏区分，⽰例如下
gene_id "STRG.1" transcript_id "STRG.1.1"
单个样本组装完成后，会合并所有样本的转录本组装结果，得到⼀个⾮冗余的转录本集合，⽤法如下
stringtie --merge -f -p 20 -f
在合并的⾮冗余转录本中，采⽤MSTRG加数字编号对基因和转录本进⾏编号，⽰例如下
gene_id "MSTRG.2" transcript_id "MSTRG.2.2"
小语种培训本质上，stringTie只提供了转录本⽔平的表达量，定量⽅式包括TPM和FPKM值两种。为了进⾏raw count的定量⽅式，官⽅提供了prepED.py脚本，可以计算出raw count的表达量，⽤法如下python prepDE.py -i -g gene_count_matrix.csv -o transcript_count_matrix.csv 输⼊⽂件为，该⽂件为\t分隔的两列，第⼀列为样本名称，第⼆列为定量的gtf ⽂件的路径，⽰例如下
sampleA f sampleB f
同时输出基因和转录本⽔平的raw count表达量值。
采⽤stringTie进⾏定量，运⾏速度快是⼀个优势，同时提供raw count, FPKM, TPM 3种定量⽅式的结果，也是其最便利的地⽅。
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