蛋清蛋白质降压肽的化学及酶稳定性研究
蛋清蛋白质降压肽的化学及酶稳定性研究
于志鹏，赵文竹，于一丁，刘博群，刘静波*
(吉林大学军需科技学院营养与功能食品研究室，吉林 长春 130062)
摘 要：以血管紧张素转化酶抑制活性为指标，通过Plackett-Burman 设计研究影响蛋清蛋白质降压肽化学稳定性的因素，同时考察蛋清蛋白质降压肽在模拟胃肠道环境中的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶裂解的稳定性。结果表明：pH 值、温度、光照、空气、贮藏肽溶液的质量浓度、巴氏灭菌处理、超声波及镁离子等因素对蛋清蛋白质降压肽的化学稳定性影响不显著(P ＞0.05)；蛋清蛋白质降压肽经胃蛋白酶和胰蛋白酶水解后活性由46.0%分别下降为13.0%和4.0%，对胃蛋白酶和胰蛋白酶均没有良好的耐受性。关键词：蛋清蛋白质；肽；稳定性；血管紧张素转化酶
Stability of Antihypertensive Peptides from Egg White Protein to Chemicals and Enzymes
YU Zhi-peng ，ZHAO Wen-zhu ，YU Yi-ding ，LIU Bo-qun ，LIU Jing-bo*(Laboratory of Nutrition and Functional Food, College of Quartermaster Technology,
Jilin University, Changchun 130062, China)
Abstract ：The stability of antihypertensive peptides from egg white protein to chemicals was evaluated by Plackett-Burman design and its stability in mimic gastrointestinal environment was also investigated by determining angiotensin converting enzyme activity. Results indicated that pH, temperature, light illumination, stock peptide concentration, Pasteurization treatment,ultrasonic treatment and magnesium ions had no significant effect on the stability of antihypertensive peptides. However, the stability of antihypertensive peptides was nsitive to pepsin and trypsin. The activity of antihypertensive peptides decread to 13.0 % and 4.0 % from 46.0 %.
Key words ：egg white protein ；peptide ；stability ；angiotensin converting enzyme进度条英文
中图分类号：TS253.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)09-0023-04
收稿日期：2009-09-24
基金项目：国家“863”计划项目(2007AA10Z329)
作者简介：于志鹏(1984-)，男，硕士研究生，研究方向为营养与功能食品。E-mail ：*********************** *通信作者：刘静波(1962-)，女，教授，博士，研究方向为营养与功能食品。E-mail ：ljb168@
血管紧张素转化酶通过影响肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统对人体血压调节有重要的生理作用[1]。研究发现，血管紧张素转化酶抑制肽(降压肽) 是一类具有抑制ACE 活性的物质。随着人们对食品安全问题的高度关注，食源性降压肽成为当前的研究热点。自1965年首次在南美茅头蝮蛇毒液中发现降压肽[2]以来，国内外研究人员已从不同来源的蛋白质中制备出各种具有降压活性的肽类物质[3-8]。但是这些研究主要集中在降压肽的高效分离制备及构效关系的研究上[9-12]，而对贮存的环境条件、加工条件和胃肠道酶耐受性等性质对其活性影响却报道很少。由于多肽中的氨基酸组成复杂，且各氨基酸性质不一，这使得其在生产、应用和贮存过程中存在着因脱酰胺、氧化、水解或环化等作用而发生降解的可能，甚至有可能导致活性完全丧失[13]。
蛋清降压肽无论是作为功能性食品还是药品，最终都要摄入人体内才能发挥其降低血压的作用。在人体胃肠道复杂的环境下，蛋清降压肽容易受胃蛋白酶及胰蛋白酶的影响，其中高活性肽段的一级结构裂解失活，在体内失去降压活性。因此蛋清降压肽的抗胃肠道酶降解的能力成为一个很值得关注的问题。研究蛋清降压肽活性稳定性对于制定科学的生产工艺和应用方法具有重要的指导意义，为进一步设计具有降压活性的抗酶解活性肽提供理论依据。
本实验在前期蛋清降压肽研究的基础上，对蛋清降压肽的化学稳定性及在体外模拟胃肠道环境中抗胃肠道酶降解的能力进行研究，为蛋清降压肽的工业化生产以及体内功能实验和在小肠内的吸收转运情况提供参考。
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1.1材料与试剂
蛋清蛋白粉吉林金翼蛋品有限公司；血管紧张素转化酶(ACE)、卡托普利(captopriL)、马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)、马尿酸(hippμric acid)、胃蛋白酶和胰蛋白酶美国Sigma公司；Alc
ala 2.4L碱性蛋白酶丹麦诺维信公司；乙腈(色谱纯) 和三氟乙酸(色谱纯) 天津市博迪化工有限公司，其他试剂均为分析纯。
1.2仪器与设备d day
LC-2010高效液相分析仪(紫外检测器、C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)和LC solution 工作站) 日本岛津公司；超速冷冻离心机美国Sigma公司；100～1000μL 移液器和10～100μL移液器 Pipette 公司；CS-501型超级恒温水浴锅上海锦屏仪器有限公司；ZD-2型自动电位滴定仪上海精密科学仪器有限公司-雷磁仪器厂；AG204型电子天平瑞士Mettle Toledo公司；HJ-6型多头磁力加热搅拌器江苏金坛荣华仪器有限公司；B-191喷雾干燥机瑞士Buchi公司。
1.3方法
1.3.1蛋清降压肽的制备
取一定量蛋清蛋白质配制成一定质量浓度的水溶液，置于恒温水浴锅中90℃热变性10min。冷却至酶解温度，用0.5mol/L氢氧化钠溶液调解pH值至酶解条件，加入一定量的
碱性蛋白酶进行水解，水解过程中不断搅拌，并不断加入适当质量浓度的氢氧化钠溶液以维持pH值在规定的范围内(±0.05)，水解3h后经80℃灭酶10min，9000×g离心10min，喷雾干燥，保存备用。
1.3.2蛋白质水解度(DH)的测定
采用pH-stat法，参考文献[14]方法进行。
1.3.3血管紧张素转化酶抑制活性测定
在Cushman等[15]方法基础上进行了一些修改。取30μL HHL底物液，加入10μL抑制剂混合均匀，在(37±0.5)℃恒温水浴中预热3～5min，然后加人20μL ACE液充分混合，37℃保温30min后，再加入60μL的1mol/L H C l终止反应，得到反应液。同时用10μL pH8.3的硼酸缓冲液替代抑制剂溶液作为空白对照组。该反应液用0.45μm滤膜过滤后直接用HPLC系统进行分析。色谱条件：柱温25℃，流速0.5mL/min，流动相乙腈-水(0.05% TFA)体积比为25:75等度洗脱，检测波长228nm。ACE抑制活性计算公式如下：
M－N
ACE抑制活性/%=———×100
Mapproach是什么意思
式中：M为空白对照组中马尿酸的峰面积；N为添加抑制剂组中马尿酸的峰面积。1.3.4蛋清降压肽化学稳定性研究
影响活性肽稳定性的因素诸多，温度、光照、超声波、湿度、缓冲盐的种类、p H值以及氧气等对活性肽的稳定性都具有不同程度的影响。实验中选定pH 值(以磷酸缓冲盐配置)、温度、光照、空气、贮藏肽溶液的质量浓度、巴氏灭菌处理、超声波及镁离子(硫酸镁盐)作为试验因素进行考察。应用Minitab 15.1.0软件对影响蛋清高F值寡肽稳定性的因素进Plackett-Burman 设计(因素水平设计见表1)。对可能影响蛋清降压肽化学稳定性的8个主要因素进行筛选，每个变量分别确定(+)和(－)两个水平，以血管紧张素转化酶活性抑制率为指标，共进行12次试验以确定每个因素对蛋清降压肽化学稳定性的影响。
因素条件低水平高水平
A pH值28
thunderbird>if only 电影
B温度/℃440
C光照无有
D空气无有
E肽质量浓度/(g/mL)10100
leftoutF高温处理无有
穿越火线英文G超声波无有
H硫酸镁无有
表 １ 蛋清降压肽化学稳定性Plackett-Burman设计因素水平表
Table 1 Factors and levels for stability of antihypertensive
peptides from egg white protein
1.3.5蛋清降压肽抗酶解研究音标查询
jocelin
在模拟胃肠道环境下，蛋清降压肽还存在活性制约其体内作用的发挥。胃蛋白酶和胰蛋白酶是胃肠道环境中的两种重要肽类水解酶，体外具有活性的肽段容易被胃蛋白酶和胰蛋白酶裂解，使其影响活性的关键氨基酸丢失，造成体外有活性而体内无活性的结果。抗胃蛋白酶和胰蛋白酶裂解能力对蛋清降压肽在体内稳定存在至关重要。因此，实验着重研究了蛋清降压肽的抗胃肠道蛋白酶裂解的能力。实验中按照《中华人民共和国药典》第五部的要求制备人工模拟胃肠液(人工胃液的配制：人工胃液取稀盐酸16.4mL，加水约800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水衡释至1000mL；人工肠液的配制：取磷酸二氢钾6.8g，加水500m L使溶解，用0.1moL/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，取胰蛋白酶10g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000mL即得)。取上述配制的人工胃液，人工肠液各10mL配制成10mg/mL的肽溶液，于37℃条件下胃液反应5h，肠液反应4h。反应结束后在100℃加热15min，5000×g，－4 ℃条件下离心5min。按1.3.3节方法进行活性测定。
