园艺学报 2011，38（2）：273–280 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail:
盐胁迫下丛枝菌根真菌对番茄吸水及水孔蛋白基因表达的调控
贺忠群1，贺超兴2,*，闫妍2，张志斌2，王怀松2，李焕秀1，汤浩茹1
（1四川农业大学园艺学院，四川雅安 625014；2中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）
摘 要：采用盆栽试验研究不同浓度（0.5%和1.0%）NaCl胁迫下接种丛枝菌根真菌Glomus mosae-2 对番茄吸水特性的影响，并用realtime-PCR技术分析了根系中5个水孔蛋白基因（LePIP1，LePIP2，
LeTRAMP，LeAQP2，LeTIP）的表达。结果表明：盐胁迫下接种丛枝菌根真菌能促进植株生长和对水分
的吸收，显著提高叶片相对含水量、叶片水势及根系水导；丛枝菌根真菌和盐胁迫共同调控了5个水孔
蛋白基因的表达；与未接菌株相比，接种植株LeAQP2基因表达上调，其余4个基因表达下调。LeAQP2
基因在接菌株根中的过量表达与盐胁迫下丛枝菌根真菌提高番茄根系水导有关。
关键词：番茄；盐胁迫；丛枝菌根真菌；吸水特性；水孔蛋白基因
中图分类号：S 641.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）02-0273-08 Regulative Effect of Arbuscular Mycorrhizal Fungi on Water Absorption and Expression of Aquaporin Genes in Tomato Under Salt Stress
HE Zhong-qun1，HE Chao-xing2,*，YAN Yan2，ZHANG Zhi-bin1，WANG Huai-song2，LI Huan-xiu1，and TANG Hao-ru1
（1College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Ya’an，Sichuan 625014，China；2Instiute of Vegetables and Flowers，Chine Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）
Abstract：Effect of arbuscular mycorrhizal fungi on regulation of water absorption and expression of five aquaporin genes（LePIP1，LePIP2，LeTRAMP，LeAQP2，LeTIP）of root in arbuscular mycorrhizal tomato by realtime-PCR were studied under different NaCl stress（0.5%，1.0%）. Results showed that the growth of tomato was improved，as while relative water content，water potential and hydraulic conductance of root were incread by AMF inoculation under salt stress. Expression of five genes was induced by AMF and salinity jointly. Up-regulated expression of LeAQP
2 gene and down-regulated of other four genes in root of AMF tomato were detected in contrast to non-AMF one. Accordingly，overexpression of LeAQP2 gene in root may be relation to enhanced hydraulic conductance induced by AMF.
Key words：tomato；salt stress；arbuscular mycorrhizal fungi；water absorption；aquaporin gene
收稿日期：2010–06–11；修回日期：2011–01–21
基金项目：国家科技支撑计划项目（2011BAD12B03）；四川省教育厅重点项目（072A064）；四川农业大学双支计划项目
* 通信作者Author for correspondence（E-mail：）
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丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）能促进干旱或半干旱环境中植物吸水，提高植株水势和根系水力学导度（简称根系水导，Lpr），因而提高其抗旱能力（Ruiz-Lozano et al.，2001；Porcel et al.，2003）。盐胁迫伴随着干旱胁迫，因此能改善盐胁迫下植株根系水分吸收及运输的因素均与提高植株的耐盐性相关。水孔蛋白（Aquaporin，AQP）是可选择性地高效转运水分子的膜（包括质膜和液泡膜）蛋白，能够介导胞内或胞间的水分跨膜运输，调节植物体内的水分快速平
衡，对于提高植物抗盐及抗旱性可能发挥着重要作用。当存在环境胁迫时，某些植物的根可能发生降低导水性的解剖结构改变，细胞内的水孔蛋白基因表达量可能发生相应变化，以调整对水分的获取（Maurel，1997；Steudle，2000）。水孔蛋白在AMF提高植物耐盐性及抗旱性中是否发生了其基因表达的变化或起到一定的作用目前尚不清楚。
目前，蔬菜设施栽培由于农药、肥料使用不当，耕作不合理致使土壤板结，次生盐渍化日趋严重。番茄是设施栽培的主要种类，利用AMF改良土壤是提高番茄产量和品质的一条新的途径。试验在明确AMF对番茄耐盐性影响的基础上，主要从与水分状况相关的几个指标着手，分析盐胁迫下AMF对番茄吸水的影响，为AMF在番茄生产上的应用提供依据。
1 材料与方法
加州大学戴维斯分校mote1.1试验材料
试验于2009年5月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室进行。供试番茄品种为‘中杂9号’，供试菌种为球囊霉属摩西球囊霉Glomus mosae-2（由匈牙利农业科学院提供）。供试土壤基本理化性状：pH 7.26，有机质11%，速效磷150 mg · kg-1，速效氮451 mg · kg-1，速效钾518 mg · kg-1。土壤过1 mm筛后于烘箱中160 ℃高温灭菌2 h，自然冷却后继续160 ℃烘2 h后放凉备用。
1.2试验设计
供试土壤装入13 cm × 13 cm的培养钵，培养钵用0.3%的高锰酸钾消毒3 h。种子用70% 酒精表面灭菌5 min后，蒸馏水冲洗催芽播种。每钵接种10 g菌剂，对照接种10 g灭菌接种物和10 mL 无灭菌接种物水滤液，以保持微生物区系一致。每盆播种3粒，出苗后间留2株，钵下放盘，如有渗漏，将渗出液反倒回去，接种45 d时测定株高、茎粗，开始进行盐处理。试验分不接种AMF（用NAM表示），接种AMF（用AM表示）两个处理，每个处理设3个NaCl水平，即0、0.5%和1.0%，每个处理15盆，共30株，无盐处理用自来水浇灌（EC为0.8 dS · m-1）。每隔2 ~ 3 d浇1次盐水，最后1次盐处理后的EC值分别达到0.9、4.2、7.1 dS · m-1。盐处理后每隔10 d测菌根侵染率，并分期取样测定叶片相对含水量、叶水势、根系水导及提取根系RNA。播种后100 d时测定株高、茎粗并算出与接种45 d时相比的增长量，收获植株分地上、地下部80 ℃烘干称质量。
1.3相关指标的测定
菌根侵染率测定：采用根段法（Kormanik & McGraw，1982）。
叶片相对含水量（RWC，%）=（鲜样质量–干样质量）/（饱和质量–干样质量）×100。
叶水势测定：选取番茄顶端第4 ~ 5叶，用美国生产的3005型压力室测定（Martinez-Balleesta et al.，2000），每个处理重复3次。
plea是什么意思
根系水导测定：将1%盐处理28 d时的植株及对照植株，洗净泥土，去除植物主茎的上半部，留下主茎的基部同根一起放入盛水的容器中，用橡胶圈密封于压力室，然后按Martinez-Balleesta等（2000）的方法测定。
2期贺忠群等：盐胁迫下丛枝菌根真菌对番茄吸水及水孔蛋白基因表达的调控 275
1.4总RNA的提取及cDNA的合成
分别提取接菌和未接菌植株经1.0%浓度NaCl水溶液和对照清水处理30 d时的根系（多株混合样）总RNA，RNA纯化后用于cDNA的合成。逆转录试剂盒为Fermentas 产品。
1.5水孔蛋白基因的RT-PCR分析
对已知番茄水孔蛋白基因LePIP1、LePIP2、LeTRAMP、LeAQP2（质膜水孔蛋白基因）和LeTIP （液泡膜水孔蛋白基因），在接菌和盐胁迫后的诱导表达进行分析。依据已知基因的mRNA序列，分别设计用于RT-PCR的特异引物（表1）。
表 1 用于RT-PCR的基因特异引物
Table 1 Gene specific primers ud for RT-PCR
引物名称Name of primers 引物序列（5′–3′）
好心没好报Primer quence
扩增长度/bp
Fragment length
基因序列号
中大mba培训Accession number
LeTRAMP F GGTGCTGGTGTTGTGAAG 314 X73848 LeTRAMP R TGCTCGTCGTTGTAGATG
LePIP1 F ATGACGCACCCATACAAC 348 AY725511
LePIP1 R TGCTAACAATGCTCCCAC
LePIP2 F AAGGATTACAAAGAGCCACC 201 BT014251
LePIP2 R ACCAAAAGCCCAAGCAAC
LeAQP2 F ATGGAGGGGAAAGAAGAGG 281 AF218774
LeAQP2 R CCAAAAGCCCAAGCAATG
LeTIP F TCATTGGTGGAGGATTGGCT 102 AY731066
LeTIP R ACACTGTTGAAGACTTGTTCTTTCTTCTT
实时荧光定量PCR仪为美国应用生物系统公司（Applied Biosystems，ABI）的7000型。SYBR Solution为TIANGEN 公司产品。
总反应体积20 μL，反应体系为：9 μL SYBR Solution，上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，无菌ddH2O 8 μL。反应条件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，68 ℃ 1 min，在68 ℃时收集荧光信号，共进行39个循环。
drawup
2 结果与分析
2.1 NaCl胁迫对菌根侵染率的影响
从表2可以看出，盐胁迫浓度显著地影响菌根侵染率。随盐浓度增加，丛枝菌根真菌对番茄根系的侵
染率降低。在同一盐浓度处理，随着盐胁迫的持续，菌根侵染率逐渐降低，且下降幅度增加。说明高盐及长时间盐胁迫均抑制菌根的形成。
表2 NaCl胁迫对菌根侵染率的影响
Table 2 Effect of different NaCl stress on AMF colonization /%
盐胁迫天数/d
Days after salt stress
NaCl/% AMF
0 10 20 30
AM 48.6 aA 50.3 aA 55.3 aA 56.2 aA
NAM 0 bB 0 dC 0 dD 0 dD
AM 47.8 aA 46.4 bB 39.6 bB 33.3 bB
0.5
NAM 0 bB 0 dC 0 dD 0 dD
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1.0 AM 48.9 aA 44.8 cB 3
2.2 cC 26.4 cC
NAM 0 bB 0 dC 0 dD 0 dD 注：数据经邓肯氏新复极差测验，不同大、小写字母分别表示P < 0.01和P < 0.05时的显著水平。下同。
Note：Data were analyzed by Duncan’s multiple new range test and the different capital and little letters indicate significant differences at P < 0.01 and P < 0.05 level respectively. The same below.
276 园艺学报38卷
2.2 NaCl胁迫下AMF对番茄的促生效应
从表3可以看出，播种后100 d时，NaCl胁迫显著地抑制了株高和茎粗的生长，降低了植株地上部和地下部干物质的积累；相同盐浓度下，与未接菌处理相比，接菌处理显著促进了番茄地上部和根系的生长。
表 3 AMF对盐胁迫下番茄幼苗生长的影响
Table 3 Effect of AMF on growth of tomato under salt stress
增长量/cm Increament 干物质量/g Dry weight
NaCl/% AMF
株高Height 茎粗 Stem diameter 地上Shoot 地下Root
0 AM 4.80 aA 0.115 aA 6.26 aA 1.37 aA
NAM 3.84 bB 0.096 bB 5.98 bB 1.10 bB
0.5 AM 2.38 cC 0.086 bB 5.64 cC 0.86 cC
NAM 2.10 dCD 0.050 cC 5.32 eE 0.67 dD
1.0 AM
2.20 cdC 0.052 cC 5.38 deDE 0.42 eE
NAM 1.80 eD 0.018 dD 5.08 fF 0.28 fF
2.3NaCl胁迫下AMF对番茄叶片相对含水量的影响
由图1可知，无盐处理接菌和未接菌株RWC无明显差异。
随盐胁迫持续，各盐处理的叶片RWC均下降，且差异渐明显。盐胁迫50 d时，0.5%盐处理的接菌株和未接菌株，其叶片的RWC分别比清水处理的对照低13.0%和19.0%；1.0%处理的则分别比对照低20.1%和35.7%。AMF接种后具有减缓番茄受盐害而失水的作用，这种作用在较高盐浓度下表现得更为明显。
图 1 NaCl胁迫下AMF对番茄叶片相对含水量的影响
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Fig. 1 Effect of AMF on relative water content of leaf in tomato under NaCl stress
2.4 NaCl胁迫下AMF对番茄叶片水势的影响
图2表明，盐胁迫降低了番茄叶片水势，而接种AMF能显著提高叶片水势（P < 0.5）。在盐胁迫45 d时接菌与未接菌株叶片水势均呈大幅度下降，0.5%和1%处理的接菌株比盐处理前分别下降1.03 MPa和1.65 MPa；未接菌株分别下降1.28 MPa和2.28 MPa；接菌株的叶片水势分别比未接菌株的高16.2%和22.6%。
2期 贺忠群等：盐胁迫下丛枝菌根真菌对番茄吸水及水孔蛋白基因表达的调控 277
图 2 NaCl 胁迫下AMF 对番茄叶片水势的影响
Fig. 2 Effect of AMF on water potential of leaf in tomato under NaCl stress
2.5 NaCl 胁迫下AMF 对番茄根系水导的影响
根系的吸水能力主要用根系水导（Lpr ）表示。图3表明，盐胁迫28 d 时，盐胁迫处理显著降低接菌及未接菌株的Lpr 。无论在无盐或盐胁迫条件下，接种AMF 的番茄根系均比未接种的有较高的Lpr 。这说明AMF 和盐胁迫均影响Lpr 。
图 3 NaCl 胁迫下AMF 对番茄根系水导（Lpr ）的影响
Fig. 3 Effect of AMF on hydraulic conductance of root in tomato under NaCl stress
clazziquai2.6 NaCl 胁迫下水孔蛋白基因的诱导表达
2.6.1 质膜水孔蛋白基因（LeTRAMP 、LeAQP2、LePIP1、LePIP2）的诱导表达
荧光定量结果表明：盐胁迫30 d 时，这4个基因的表达均受AMF 和盐胁迫的共同影响（图4）。AMF 及盐胁迫显著上调LeTRAMP 和LePIP2基因的表达。无盐处理时，接菌株的显著高于未接菌株的，而盐胁迫下则相反（图4，A 、D ）。
LeAQP2是番茄质膜上对水专一通透的水通道蛋白。由图4，B 可见，无盐处理时，AMF 及盐胁迫均下调番茄根系LeAQP2基因表达。盐胁迫下，接菌株该基因的表达量显著高于未接菌株。
由图4，C 可以看出，无盐处理时，AMF 侵染及盐胁迫均下调根系中LePIP1基因的表达。盐胁迫下，接菌株此基因的表达量显著低于未接菌株的。
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