Thermo Accela UPLC
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工作原理及使用说明
仪器特点
型 号：Accela 制造厂商：Thermo，美国
主要技术指标：流速范围：0.001～1ml/min、 压力：操作压力为0～15000bar 检测器：二极管阵列检测器、 波长范围:190～800nm
高效液相色谱的基本原理：
液相色谱工作流程图
由流程图可以看出系统由流动相、高压泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内。由于样品溶液中的各组分在色谱柱中的淋洗液和固定相间两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，经过一定的柱长后，便彼此分离，顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流信号经放大后，在记录器上描绘出各组分的色谱峰。
高效液相色谱仪的应用
高效液相色谱法只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制，流动相可选择的范围宽，固定相的种类繁多，因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。与试样预处理技术相配合，HPLC所达到的高分辨率和高灵敏度，使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能，能够分离复杂体系中的微量成分。
UPLC应用特点：
UPLC（ultra performance liquid chromatography），除了具备和常规HPLC类似的分析特点外，由于中国进入3g时代
idiot是什么意思可承受高压力，可使用细粒径液相色谱柱，因此在分离度和分离速度上具有较大优势，同时可以减少溶剂的使用量。但因此也对溶剂及样品预处理及仪器的使用和维护有更高的要求。
操作规程
一、准备工作
1．查阅文献，获得目标分析物质或相近物质的液相色谱分离条件。
2．检查线路是否连接完好。检查流动相、洗针液是否充足，不足则根据要求添加。 3．有机流动相必须为进口HPLC级，水相可使用Millipore纯水机出水或娃哈哈屈臣氏纯净水。所有流动相在使用前均需用0.2μm的滤膜过滤（水和缓冲液用水相滤膜，有机相用有机相滤膜），其中水相需每天更换以保持新鲜。
tesla coil4．标样和样品在使用前必须用0.2μm的针头式滤器（进口非分装）过滤。
5．将样品放置在样品托盘上，并记录相应的位置。且第一个和最后一个样品为不含营养盐的流动相，用于清洗进样系统及管路。
二、开机
1．打开稳压电源（指针指示220V），打开仪器面板Accela AS、Accela PDA、Accela Pump 电源开关。
2．打开电脑，双击工作软件Xcalibur，在status状态栏下看到AS、PDA、Pump三项显示ready to download；仪器面板灯除Pump部分的RUN灯呈橙色外，其余灯均为绿色，
表明仪器及通讯正常，可进行下一步操作。
3． purge管路系统，直至无气泡。方法如下：打开Accela Pump左侧的门，将塑料针筒接到purge阀的输出管上，逆时针拧松purge阀；将Accela pump中的purge阀拧到左边；点击软件双击Roadmap中Instrument Setup图标，显示Instrument Setup界面，点击左侧仪器图标中的Accela Pump，点击下拉主菜单中Accela Pump栏中的direct control跳出该界面；在“take pump under control”栏打勾，输入flow为600μl/min，选择相应的流动相（设为100%），点击play键开始purge，10min左右可按停止键；同样的方法可purge其它流动相通道，直至管路中没有气泡。Purge完后将purge阀顺时针拧到右边，取下针筒中的废液倒入指定的废液桶。
4．检查Accela AS门上自动进样针筒上部黄色密封圈上端是否有气泡，如有气泡则要先行排气，方法如下：点击软件双击Roadmap中Instrument Setup图标，显示Instrument Setup界面，点击左侧仪器图标中的Accela As，点击下拉主菜单中Accela As栏中的direct control跳出该界面；选择Flush syringe，
点击apply（注意此时要关上AS的门）；连续数次赶尽气泡。
5． 稳定泵系统。双击软件Roadmap中Instrument Setup图标，显示Instrument Setup 界面，点击左侧仪器图标中的Accela Pump，点击下拉主菜单中Accela Pump栏中的direct control跳出该界面；在“take pump under control”栏打勾，输入所需流动相启动泵系统，运行20min后方可进行其它操作（如运行quence）。
三、创建分析方法
1．建立method
打开UPLC工作站Xcalibur，双击Roadmap界面中的Instrument Setup图标，点击Accela AS、Accela PDA、Accela Pump图标分别设置参数。
英文名字Accela AS参数设置：除Injection volume（可设为1-20μl）外，其余参数请不要更改。
Accela PDA参数设置：根据样品实际情况对run lengthtime、spectra、channels 等进行设置。
Accela Pump参数设置：选择Gradient Program界面，编辑流动相梯度（注意正确选择通道，以免气泡进入系统）
wema参数设置完后保存方法（默认路径为：d:\UPLC\method\）。
2．建立quence
点击quence view图标进入quence编辑界面。对于已建分析方法的样品，可直接在原来的quence内添加样品信息。新建quence，样品类型选择Unknown，双击Inst Meth和ProcMethod（如没有工作曲线时可先不填此项）输入方法名及定量分析方法，输入分析样品在Accela As中的位置以及进样量，以此类推编辑整个序列，遍及完后保存序列，并点击按钮 运行
四、样品分析
1．点击按钮real time plot play可以看到实时采集的数据。开启仪器半小时左右，可观察到仪器信号基线平稳。
2．quence设置完毕后，点击run quence进行样品分析（注意选择所需分析样品的序列号）。
3．在做标样时，标样也先作为未知样品分析，待所有样品分析完后再进行定量分析。
五、分析结束整流器
1．进样系统清洗：以不含营养盐的流动相为样品（最后一个样品）run2-3次，清洗进样系统。
2．管路及柱系统清洗（重要）：用一定比例的有机相和纯水（不含缓冲盐以及甲酸、乙酸、醋酸铵等其它添加物）流动相洗柱, 至无明显出峰为止。最后用80%以上的有机溶剂保存柱子。
3．关闭工作站窗口，退出工作站；关闭仪器面板Accela AS、Accela PDA、Accela Pump 电源开关；关闭电脑，关闭稳压电源。oel
4．取出样品瓶，清洁桌面，在仪器使用记录本上登记。
六、数据处理
敏锐的意思1．定量分析过程（建立工作曲线）参考“Xcalibur 定量分析”说明书。
2．未知样品结果分析，打开quence在Pro Meth中输入定量分析方法。选择需计算浓度的样品，点击Batch Reprocess Setup，选择Quan栏，Peakdetection&Intergration
以及Quantitation（注意其余选项不要打勾），点击OK。
3．点击Roadmap进入Quan Browr，打开quence文件名，选择显示所有数据，点击unknows查看样品结果。
注意事项：
1．每次开机都先purge流动相管路及自动进样机械手以防止起泡进入系统。
2. 安装色谱柱时注意流动相的方向，开机前注意流动相瓶内是否有足够流动相、洗针液瓶内是否有足够洗针液，自动进样器syringe内是否有气泡。
3．所有需戴手套进行的操作（包括样品预处理及流动相过滤等），必须使用无尘手套（其它手套中的粉末会堵塞管路及色谱柱，造成严重损失）。
4．拭擦仪器管路及其它部件时必须使用无尘纸。
5．样品瓶隔垫必须购买进口产品，且一次性使用，以免密封垫片的碎屑堵塞进样针及UPLC 系统。
6. 实际样品必须事先用0.2um的进口滤膜过滤才可使用。
7.使用过程中注意观察系统压力，压力升高时考虑清洗柱前滤芯。
8．氘灯使用寿命有限，仅进行数据分析时，可以关闭UPLC仪器上的三个电源按钮，或点击软件双击Roadmap中Instrument Setup图标，显示Instrument Setup界面，点击左侧仪器图标中的Accela PDA，点击下拉主菜单中Accela PDA栏中的direct control，选择configure界面，将相应的光源turn off，但频繁开关也会缩短灯寿命。
9．卸下自己使用的分析柱后请将重点实验室两通接上，避免流动相管路暴露于空气之中。10．注意废液瓶中废液的液位，废液倒至指定废液桶。
11.使用UPLC由于开机稳定及关机前清洗时间较长，请早上9点前来实验室开机，下午不允许开机使用仪器。
savanna12．由于和LCMS共用房间，注意保持室内清洁，不要接触任何和UPLC无关的电源开关，未经许可不要使用LCMS及其控制电脑，实验结束后请勿关闭空调。
