第49卷第2期2015年3月生㊀物㊀质㊀化㊀学㊀工㊀程Biomass Chemical Engineering Vol.49No.2Mar.2015doi:10.3969/j.issn.1673-5854.2015.02.005㊃研究报告 生物质化学品㊃
Glucobacter oxydans 全细胞直接催化秸秆稀酸
预处理水解液产木糖酸
麻艺聪1，周鑫1,2，缪园园1,2，徐勇1,2∗
，勇强1,2，余世袁1,2
(1.南京林业大学化学工程学院，江苏南京210037;2.江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室，江苏南京210037)
摘㊀要：以长期驯化选育得到的耐抑制物氧化葡萄糖酸杆菌Glucobacter oxydans NL71为催化菌株，对全细胞直接催化木质纤维(麦秆)稀酸预处理水解液产木糖酸的工艺进行研究㊂结果表明：未脱毒水解液对催化反应生产木糖酸具有抑制作用，且随浓度提高，抑制作用增强㊂提高细胞浓度和提高供氧能力可以有效抵抗麦杆稀水解液的抑制效应㊂在摇瓶体系中以2g /L 细胞接种量直接催化未经脱毒的麦秆稀酸水解浓缩液，当初始木糖质量浓度超过100g /L 时，细胞的催化性能受到严重抑制，木糖酸得率均低于50%；当细胞接种量提升至8g /L 时，木糖酸得率可以达到85.7%；在机械搅拌式通氧加压反应体系中，
采用密封加氧技术对100g /L 木糖浓度的麦秸稀酸水解浓缩液全细胞催化24h 的细胞接种量8g /L ，木糖酸终质量浓度达到103.1g /L ，木糖酸得率可达到93.1%，产生速率为摇瓶体系的1.6倍㊂
关键词：木糖酸；木糖；全细胞催化；氧化葡萄糖酸杆菌；麦秆水解液
中图分类号:TQ35㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀文献标识码:A㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:1673-5854(2015)02-0021-06Production of Xylonic Acid from Dilute Sulfuric Acid Hydrolysates of Wheat Straw with Whole-cell Catalysis of Glucobacter oxydans
MA Yi-cong 1,ZHOU Xin 1,2,MIAO Yuan-yuan 1,2,XU Yong 1,2,YONG Qiang 1,2,YU Shi-yuan 1,2(1.College of Chemical Engineering,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China;2.Jiangsu Key Laboratory of Biomass-bad Green Fuels and Chemicals,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China)
Abstract :The production of xylonic acid from hydrolysates of straw by whole-cell catalysis was investigated with long-term domesticated Gluconobacter oxydans as catalytic strain.The results showed that the catalytic reaction could be inhibited by hydrolysates without detoxication,and the inhibitory effect was more obvious with the increa of concentration.However,it could be counteracted by increasing inoculation quantity and dissolved oxygen.In the shake flask system,with
英语短文改错the inoculation amount of 2g /L and the xylo concentration of hydrolysates more than 100g /L,the performance of cell catalysis was inhibited riously,and the yield of xylonic acid and utilization rate of xylo were all lower than 50%.When the inoculation amount incread to 8g /L,the yield of xylonic acid reached 85.7%.The method of compresd oxygen supply in the aled aerated stirred tank reactor was investigated,and in 24h the concentration and yield of xylonic acid reached 103.1g /L and 93.1%,respectively.And the production rate incread 1.6folds compared with that of the shaker system when xylo concentration of hydrolysates was 100g /L and inoculation amount dans was 8g /L.
Key words :xylonic acid;xylo;whole cell catalysis;Glucobater oxydans ;straw hydrolysates ㊀㊀收稿日期:2015-01-16㊀㊀基金项目：国家自然科学基金资助项目(31370573)；国家863计划资助(2012AA022304)；江苏研究生创新课题(KYLX_0880)㊀㊀作者简介：麻艺聪(1993 )，陕西渭南人，本科生，研究方向：植物纤维资源生物炼制㊀∗通讯作者：徐勇，教授，博士生导师，研究领域：植物纤维资源生物炼制;E-mail :xuyong@njfu.edu㊂
植物纤维素资源中可利用的糖类主要是纤维素和半纤维素，其中以纤维素为原料的葡萄糖发酵工业相对成熟㊂然而，植物纤维中以木糖为主的半纤维素约占20%~35%，其高效转化与利用则成为整个
22㊀生㊀物㊀质㊀化㊀学㊀工㊀程第49卷生物炼制系统的关键性技术瓶颈之一[1-5]㊂近年来，木糖酸作为植物纤维资源木糖高效生物转化利用的新兴产品具有广阔的工业应用潜力[6-9]，被美国能源部确定为植物纤维资源生物质炼制最具发展前途的30种目标产品或化工基本构件单元之一㊂Zhou等[10]利用长期驯化选育的菌株葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)NL71优良的生产性能，在富含D-木糖经CaCO3或Ca(OH)2中和吸附脱毒后的玉米秸秆稀酸预处理浓缩液中，直接采用全细胞催化转化生产木糖酸，产量可达到143.9g/L㊂Buchert 等[11]研究表明G.oxydans可催化经脱毒后玉米秸秆稀酸水解液中100g/L木糖转化为88g/L木糖酸㊂Zhou等[10]对G.oxydans在摇瓶体系单一木糖催化生产木糖酸，得率可达98%以上，因此认为利用氧化葡萄糖杆菌直接以半纤维素水解液为底物催化生产木糖酸具有较好前景㊂本研究以小麦秸秆稀酸预处理水解浓缩液为原料，以NaOH替代CaCO3作为中和剂保留所有的抑制物阴离子，对G.oxydans NL71全细胞直接催化制取木糖酸的生产工艺进行优化，期望为麦秆木糖的高效生物转化与利用提供借鉴和指导㊂
1㊀实验
1.1㊀原料、试剂及仪器
小麦秆，来自江苏连云港㊂NaOH㊁山梨醇㊁硫酸㊁硫酸镁㊁磷酸二氢钾㊁磷酸氢二钾和硫酸铵，均为分析纯；酵母粉为生化级㊂
Agilent1260液相色谱，美国安捷伦公司;ICS-5000离子色谱，美国赛默公司;Ledend Mach1.6R型离心机，美国赛默公司;Spectrumlab752s紫外可见分光光度计;BioFlo®/CelliGen®115发酵罐，美国新布朗什维克科学公司;FB6410火焰光度计，上海精科有限公司㊂鹿儿岛大学
1.2㊀菌种及培养基
氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)NL71，经南京林业大学在木质纤维水解液长期驯化选育后保藏㊂活化培养基(g/L)：山梨醇50，酵母粉5㊂摇瓶及发酵罐水解液培养基(g/L):MgSO4㊃7H2O0.5, KH2PO41,K2HPO4㊃3H2O2,(NH4)2SO45，酵母粉5[5]㊂
1.3㊀麦秆水解液全细胞催化
1.3.1㊀麦秆稀酸预处理水解液制备㊀称取一定质量的麦秆(直径1~3cm)按固液比为1ʒ10(gʒmL)加入质量分数为1.0%的硫酸浸泡过夜，置于蒸煮反应器中，在150ħ的条件下反应30min[9]，取出物料后经磨浆㊁过滤得滤液即为麦秆稀酸预处理水解液㊂
1.3.2㊀不同初始浓度麦秆水解液的全细胞催化㊀麦秆稀酸预处理水解液经减压真空浓缩至木糖质量浓度分别为60.2㊁73.6㊁89.2㊁100.9㊁121.7㊁139.7㊁164.5和179.3g/L，并以30%的NaOH溶液调至pH值6.0㊂在250mL三角摇瓶中加入50mL水解液并按2g/L菌体接入量加入活化后的G.oxydans NL71细胞，于30ħ和220r/min条件下催化反应96h，每6h检测并加入30%的NaOH溶液维持pH值6.0㊂
1.3.3㊀不同细胞浓度的全细胞催化㊀麦秆稀酸预处理水解液经减压真空浓缩至木糖质量浓度100g/L，以30%NaOH溶液中和至pH值6.0，在250mL三角摇瓶加入50mL水解液并分别加入2㊁4和8g/L活化后的G.oxydans NL71细胞，于30ħ和220r/min条件下催化反应96h，每6h检测并加入30%的NaOH溶液维持pH值6.0㊂
1.3.4㊀机械搅拌通氧加压全细胞催化㊀麦秆稀酸预处理水解液经减压真空浓缩至木糖质量浓度100g/L，以30%NaOH溶液调至pH值6.0，在机械搅拌反应体系加入1L麦秆稀酸水解液并按8g/L菌体接入量加入活化后的G.oxydans NL71细胞，于30ħ和500r/min条件下采取通氧加压方式催化反应24h，使用30%的NaOH溶液在线调节pH值6.0㊂
1.4㊀分析检测及计算方法
1.4.1㊀糖及糖酸的色谱分析检测[8]㊀采用离子色谱分析㊂色谱柱,CarboPac TM PA10(2mmˑ250mm);
第2期麻艺聪，等:Glucobacter oxydans全细胞直接催化秸秆稀酸预处理水解液产木糖酸23
㊀
柱温30ħ；流动相采用0.2moL/L NaOH溶液梯度洗脱，流速0.3mL/min，四电位脉冲安培检测器(PAD)以外标法检测；进样量10μL㊂糖利用率=消耗糖含量ˑ100%/初始糖含量；己糖酸(半乳糖酸㊁葡萄糖酸
2014年开学第一课主题和甘露糖酸)得率=己糖酸含量ˑ100%/(己糖含量ˑ1.089)；戊糖酸(阿拉伯糖酸和木糖酸)得率=戊糖酸含量ˑ100%/(戊糖含量ˑ1.107)；糖酸产生速率=糖酸含量ˑ100%/催化反应时间㊂1.4.2㊀抑制物的色谱分析检测㊀采用液相色谱分析抑制物甲酸㊁乙酸及乙酰丙酸㊂色谱柱,Aminex Bio-Rad HPX-87H；流动相5mmol/L H2SO4，流速0.6mL/min；柱温55ħ；示差折光检测器温度30ħ；进样量10μL㊂
1.4.3㊀菌体浓度的测定㊀采用比浊法，取全细胞催化水解液经8000r/min离心5min后再以0.9%生理盐水重复洗涤2遍，稀释至一定浓度后在0.5cm光径的比色皿中测定600nm处的吸光度值，即为菌体浓度(OD600)㊂泰语入门
1.4.4㊀钠离子浓度测定㊀采用火焰光度法按照按罗马金公式进行定量分析，取全细胞催化水解液经8000r/min离心5min后由0.22μm滤膜过滤，稀释1000倍，再经雾化器将试液雾化通过光电系统测量㊂
2㊀结果与讨论
2.1㊀麦秆稀酸水解液成分
麦秆经过稀酸水解预处理并经过过滤得到麦秆稀酸水解液，其主要成分如下：木糖26.82g/L，葡萄糖6.02g/L，阿拉伯糖4.69g/L，半乳糖2.63g/L，纤维二糖2.11g/L，甲酸1.17g/L，乙酸2.89 g/L，乙酰丙酸0.12g/L㊂由数据可以看出在稀酸预处理液中，主要成分为木聚糖的降解产物木糖；此外木聚糖侧链
基团阿拉伯糖基在高温下降解而释放的阿拉伯糖，少量纤维素在高温酸性条件下降解成纤维二糖和葡萄糖[9]；降解生成的糖类物质以及木质素降解的多种单环芳香族化合物在高温或酸的作用下还会进一步发生分解和氧化反应，产生有机酸(甲酸㊁乙酸和少量的乙酰丙酸)㊁醛类(糠醛㊁羟甲基糠醛)及芳香族化合物等对微生物生长和代谢具有抑制作用的副产物㊂这些副产物通过抑制微生物的有氧呼吸㊁增加细胞膜的透性㊁破坏酶活性等抑制微生物菌体生长和产物生成，甚至具有致死毒性[12]㊂
利用水解液催化之前需要预先调节pH值至近中性，在改变pH值的同时可以改变一些抑制物的电离特性，从而达到降低毒性的目的㊂而通常水解液采用氢氧化钙中和调节pH值，虽然使用Ca(OH)2可在去除糖液中的SO2-4同时能吸附部分糠醛㊁羟甲基糠醛等有害抑制物，但是由于采用1%硫酸预处理同时随着浓度提高浓缩溶液中含有大量SO2-4，在酸碱中和过程中析出大量硫酸钙沉淀，对糖的吸附也大幅增加，总糖损失率甚至会超过20%[13]㊂因此，采用NaOH溶液中和能有效减少硫酸钙固体废弃物，减少因硫酸钙吸附造成的糖的损失㊂与此同时，在利用水解液为原料生产木糖酸过程中为提高生产效率必须对水解液进行浓缩处理提高木糖浓度，然而随着木糖质量浓度提升抑制物与钠盐浓度亦随之增加，其对全细胞催化性能存在严重的抑制甚至致死毒性㊂因此，研究和寻求最适的细胞催化工艺条件及抑制物消减脱毒技术是必要的㊂
牛津英语2.2㊀初始木糖浓度对全细胞催化的影响
为了测试未经任何脱毒处理的麦秆稀酸水解液浓度对全细胞催化的影响，选取了不同浓度的麦秆水解液进行实验，实验结果如表1所示㊂当麦秆水解液木糖质量浓度在60~80g/L之间时，木糖利用率高于90%，木糖酸得率在70%左右㊂然而，当麦秆水解液浓缩木糖质量浓度达100g/L时，全细胞催化明显受到抑制，产生的木糖酸质量浓度36.5g/L，残余木糖质量浓度57.1g/L，木糖酸得率仅32.7%㊂当浓缩木糖质量浓度超过120g/L，细胞催化几乎难以维系㊂
㊀㊀尽管木质纤维素预水解液中的木糖占总糖的70%以上，但是除此之外其中还含有其它多种单糖㊁低聚糖和抑制物组分，它们对微生物的木糖代谢存在着如糖底物竞争效应㊁膜蛋白与通透性改变㊁酶活
24㊀生㊀物㊀质㊀化㊀学㊀工㊀程第49卷力抑制㊁关键酶与蛋白质基因的表达调控㊁细胞生长和遗传等多方面的影响，并且还可能与发酵工艺条件形成复杂的交互效应，最终限制木糖的代谢和木糖酸的产出，并且该抑制效应在细菌发酵过程中的表现更加突出[14]㊂实验结果表明，即使在低浓度的水解液中的糖酸催化生产性能也会受到严重抑制，此时即使木糖被完全代谢木糖酸的得率仍低于70%，换言之消耗的木糖并未完全转化为木糖酸㊂此外，伴随着秸秆水解液浓度的增加木糖酸得率明显下降㊂基于G.oxydans 的细胞代谢特征，分析认为：在低浓度麦秆稀酸水解液中,G.oxydans 可能会通过Dahms 途径消耗部分木糖或木糖酸[15]，用以维持细胞生长或碳骨架分解以抵御抑制物的抑制作用；而随着秸秆水解液浓度增加抑制物含量也随之增加，最终使得G.oxydans 的细胞活性被严重抑制，仅
能够在细胞催化初期利用细胞膜上原有的木糖脱氢酶，表现出
对木糖的基本催化能力，仅有木糖酸产出且得率低于10%㊂
表1㊀不同初始木质纤维水解液质量浓度催化反应结果对比
Table 1㊀The results of catalytic reaction with different concentrations of lignocellulosic hydrolysates
初始木糖/(g㊃L -1)initial concentration of xylo 木糖酸/(g㊃L -1)concentration of xylonic acid 残余木糖/(g㊃L -1)concentration of residual xylo 木糖酸得率/%yield of xylonic acid 60.247.00.771.073.656.0 4.269.289.259.721.3
51.9
100.936.557.132.7
121.7
thinkquest
23.8
99.617.8139.710.9129.87.1164.511.3150.4 6.3179.313.3163.1 6.7
2.3㊀细胞浓度对全细胞催化的影响
在微生物发酵过程中采用高接种量可以缩短菌体调整适应期，使产物生成高峰提前，并可减少杂菌污染风险㊂同时，利用生物的种群体密度及感应效应(如种内互助)还可以有效消减抑制效应，提高微生物转化生产性能㊂在含100g /L 木糖的麦秆水解液中分别加入2㊁4和8g /L 的G.oxydans
colorful
细胞图1㊀不同细胞浓度对全细胞催化的影响Fig.1㊀The effect of the cell dosage on the catalysis
催化反应96h，以考察高浓度细胞接入是否能改变高浓度水
解液对全细胞催化的抑制作用，结果如图1所示㊂
lander㊀㊀结果表明，当接种量为2㊁4和8g /L 时，催化反应96h 产生的木糖酸质量浓度分别为36.5㊁73.3和94.9g /L㊂
相比于接种量为2g /L，当接种量为4和8g /L 时木糖酸的
产量分别提高了约1倍和1.6倍㊂由数据可知随接种量
的增大，木糖酸产生速率也随之加快,48h 接种量8g /L 时
木糖酸得率85.7%，产生速率为1.98g /(L㊃h)，相对于2
和4g /L 接种量产生速率提高了约1.6倍与0.3倍㊂分析
认为，菌体细胞本身对抑制物(如：醛类㊁酚类及芳香族化
合物)具有一定吸附或氧化能力[16]，因而通过提高
2.4㊀通氧加压对全细胞催化性能的影响G.oxydans 属于严格好氧菌，在全细胞催化过程中需要高通风
量提供充足的氧以用于完成氧化反应，而木质纤维素水解液通常除了含有多种糖类，还含有许多胶质㊁有机氮源㊁脂质及木质素等复杂化合物，在通风条件下极易产生泡沫造成传氧阻力㊁料液逸罐和杂菌污染等问题，需要添加大量的消泡剂；另外，木糖转化为木糖酸时会迅速降低培养体系的pH 值并最终抑制细胞的催化反应，因此在工业生产中
第2期麻艺聪，等:Glucobacter oxydans 全细胞直接催化秸秆稀酸预处理水解液产木糖酸25㊀必须建立实时在线的中和技术㊂为解决上述关键性障碍，徐勇等[17]提出一种通氧加压全细胞催化体系，即用高纯度的氧气加压的专利技术代替空气直接通入密封的全细胞反应体系，在此反应体系中，并采用CaCO 3进行在线中和，首次实现了木质纤维水解液的特高浓度的高效转化[10]，但是在反应过程中CaCO 3中和木糖酸所生成的CO 2仍然需要定期排放操作㊂利用该技术原理，以NaOH 溶液替代CaCO 3作为木糖酸的中和剂，期望能够解决CO 2的定期排放操作不便的问题㊂在3L
密封加氧的机械搅拌式
图2㊀通氧加压条件下，麦秆水解液全细胞催化反应历程Fig.2㊀Cell catalytic reaction of hydrolysates under the condition of compresd oxygen supply
反应器中，以含100g /L 木糖的麦秆稀酸水解液为offshore
原料接入8g /dans 菌体，使用30%NaOH 溶
打印机培训液在线调控pH 值6.0得到的木糖酸全细胞催化反
应历程如图2所示㊂结果表明：在一定的木糖浓度
范围内，完全可以采用NaOH 溶液替代CaCO 3作为
木糖全细胞催化产木糖酸的中和剂，避免了CaCO 3中和的CO 2废气生成与排放问题，显著简化了生产操作㊂尽管麦秆水解液钠离子质量浓度超过20g /L,
由表2可看出只需反应24h 木糖利用率就可以接
近100%㊂
㊀㊀表2给出了机械搅拌体系反应24h 的结果及其与摇瓶体系结果的对比，由表2可知，在机械搅拌体系中产生的木糖酸质量浓度为103.1g /L，对应的产品得率达93.1%，产生速率达到4.29g /(L㊃h)，同比为摇瓶反应体系的1.6倍㊂于此同时,G.oxydans 细胞也能够同步催化氧化阿拉伯糖和半乳糖生成相应的糖酸(钠)㊂由此可见，与摇瓶体系相比，采用通氧加压反应体系可以大幅度提高溶解氧水平从而促进细胞呼吸作用及提高氧化酶的催化反应动力学，最终使G.oxydans 细胞成功克服木质纤维水解液中复杂抑制效应，实现木质纤维原料稀酸水解液中包括木糖在内的阿拉伯糖㊁半乳糖等半纤维素糖类组成的糖酸转化㊂通过半纤维素糖类的全细胞共催化生产多糖酸产品，进而带动和实现原料中半纤维素的分类高效生物转化与利用，整体提升木质纤维资源生物炼制的原料全值化利用水平及经济效益㊂
表2㊀摇瓶及机械搅拌体系催化反应24h 结果对比
Table 2㊀The results of catalytic reaction in 24h with different reaction systems
催化反应体系catalytic system 木糖酸/(g㊃L -1)concentration of xylonic acid
残余木糖/(g㊃L -1)concentration of residual xylo 木糖酸得率/%yield of xylonic acid 木糖酸产生速率g /(L㊃h)production rate of xylonic acid 摇瓶shake flash
64.7
42.458.4 2.70机械搅拌aerated stirring 103.10.793.1 4.29
3㊀结论3.1㊀通过对不同初始浓度水解液G.oxydans 催化性能的研究，表明未脱毒水解液对催化反应生产木糖酸具有抑制作用，且随浓度提高，抑制作用增强㊂
3.2㊀提高细胞接入量可以提高G.oxydans 细胞对抑制物的拮抗效应及对钠盐的耐受性从而提高了细胞催化水平及木糖酸产量㊂采用8g /L 的G.oxydans 直接催化含100g /L 木糖的麦秆稀酸水解浓缩液,
48h 时木糖酸得率可达到85.7%，产生速率1.98g /(L㊃h)㊂3.3㊀利用机械搅拌通氧加压与高细胞浓度相结合的全细胞催化技术可以进一步显著提高木糖酸的得率，并且可以实现NaOH 在线中和技术以避免加入CaCO 3中和而造成的CO 2排放问题㊂采用8g /L 的G.oxydans 细胞直接催化100g /L 麦秆水解液24h 的木糖酸得率为93.1%，产生速率达到4.29g /(L ㊃h)，为摇瓶体系的1.6倍㊂
