⼆代测序中的⽬标区段捕获技术简介⼆代测序已经问世⼗年了，最突出的特点就是通量的急剧增加和测序成本的急剧下降。现在1000美元即可完成个⼈的全基因组测序的⽬标已经实现了。但是很多⼈并不关⼼全基因的序
列，只是关⼼部分基因序列或者区段，这样如何在测序前将这些区段富集就是⼀个研究的热点了，因此催⽣了测序前⽬标区段捕获的研究。韩文网站
本⼈将介绍⼀下现在常⽤的⽬标区段捕获技术，这些技术主要分为三类:hybridcapture（杂交捕获）,molecular inversion probes（分⼦倒置探针，MIP）和 PCR。
注：说明引物池的问题，因为有些科研⼈员是针对某个基因进⾏全测序，那么设计引物时相邻的引物是有over
1.杂交捕获
杂交捕获的原理是⼈为设计探针（DNA或者RNA形式），探针可以和⽬标区段部分或者全部互补。将样本和探针混合，探针会将⽬标区段捕获，未设计探针的区段会被洗脱丢弃，之后通过变性（⼀般是调节PH值到碱性）将探针和捕获区段分开，被捕获的⽚段即可进⾏⼆代测序⽂库构建。
根据探针的状态不同，杂交捕获⼜因为杂交状况不同分为固态杂交和液态杂交。考研时间2020具体时间
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area 11A 固态杂交：本质就是芯⽚，芯⽚上布满了探针，典型的是罗⽒公司的NimbleGen。其特点是DNA探针，探针长度为50-105bp不等。其探针密度和序列都可以由研究⼈家⾃⼰设置（相对⽽⾔，针对⼀个区段的探针密度越⼤，其捕获成功率越⾼）。
B 液态杂交：探针存在液相中。探针携带⽣物素，当探针和⽬标区段杂交完成后，通过磁珠可以将探针吸附（此时探针有携带⽬标区段的和空探针），将未被捕获的⽚段扔掉。之后通过变性可以将探针和⽬标区段分开，然后利⽤磁珠将所有空探针吸附丢弃，⽬标区段捕获完成。典型的是安捷伦公司的AgilentSureSelect技术，其探针是RNA探针，长度在120bp（illumina公司的illumina TrueSeq探针为DNA，长度为95bp的液态探针）。
杂交捕获的优缺点：
杂交捕获最⼤的优点是捕获区段⼤，可以达到⼏百MB，远超PCR⽅案和MIP⽅案，同时根据探针的原理其均⼀性很好（均⼀性是评价捕获技术很关键的参数，均⼀性好后续测序成本就会下降）。但是杂交捕获的缺点也是明显，因为杂交前样本会被随机打断（⼀般认为500bp是⽐较合适的长度），探针捕获时可能和⽬的⽚段部分杂交，导致⼀些含有部分⽬标区段的⽚段被捕获。所以杂交捕获的特异性较差，容易捕获⾮⽬标区段。
2. MIP
MIP技术本质上是以连接-PCR反应捕获的技术，其优势是特异性好⽽且捕获完成后的⽚段直接完成了建库（杂交捕获后还需要构建测序⽂库，主要是添加index和测序接头）。其原理是设计⼀个⼝袋状探针，探针分为三部分（如上图），蓝⾊部分为通⽤序列（为后续构建⽂库所⽤），探针的5端和3端（彩⾊）能和⽬标区段退⽕，然后利⽤DNA聚合酶将探针缺⼝补齐，同时添加DNA连接酶，将缺⼝处磷酸⼆酯键连接，即可构成⼀个完整的环状探针。剩余未捕获探针和DNA序列通过外切酶消化（完整环状探针不受外切酶影响）。
完整的环状探针已近包含了⽬标区段序列。利⽤蓝⾊通⽤序列作为后续⽂库构建的引物（同时添加index和测序引物），扩增后产物可以直接作为⼆代测序⽂库。
MIP的有点是特异性好，捕获区段位于中游，⾼于PCR⽅案，但是低于杂交捕获⽅案。同时其缺点是捕获效率不⾼，有些区段难以设计探针和捕获。
3.PCR
PCR⽅案是本⼈的研究项⽬，同时PCR-⽬标区段捕获也是商业化应⽤最⼴泛的，因为什么呢！⾸先是便宜，不管引物的设计还是体系的价格都是最简单的，⽽且设计门槛低，不需要特殊的实验设计。相对于杂交捕获的花费（探针和杂交条件），多重PCR-⽬标区段捕获是极低的花费，⽽且适合⼤规模样本（这是本⼈研究多重PCR⽅案的关键，最适合⼤规模样本和少⽚段的富集。PCR富集⼿段实在太
多，有长⽚段PCR，短⽚段PCR，乳液PCR，拯救PCR等等（都可以开个专题了），这⾥本⼈只介绍3种商业化的，经过市场验证的⽅案（这三种⽅案都是多重PCR）。
a place in the sun1） Ion Ampliq（ThermoFisherScientific）
Ion Ampliq技术最关键的地⽅是引物设计，Thermo公司⾮常厉害，引物设计的⼈员实在太厉害（申请了专利），他们设计的引物可以满⾜1000-2000重单管反应不产⽣影响后续分析的引物⼆聚体和⾮特异产物。该⽅案就是你给需要捕获的序列，⼈家设计好引物池给你，你直接按照说明书做就好了。
备注：说明引物池的问题，因为有些科研⼈员是针对某个基因进⾏全测序，那么设计引物时相邻的引物是有overlap的（也是为了⼆代测序数据处理准确性，必须要有的），因此扩增时需要把相邻的引物分在两管内，防⽌相邻引物的上游和下游相互作⽤。
2）illumina TrueSeq（illumina）
该⽅案和MIP⽅案类似，也是以延伸-连接-PCR三部分组成的⽂库构建⽅案。针对⽬标区段设计两段探针（和引物长度⼀致18-21bp即可），探针和DNA双链中⼀条链杂交（两段探针杂交在⼀条链上），通过DNA聚合酶和DNA连接酶的作⽤，将两探针间缺⼝补齐。上下游探针携带有通
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⽤序列，之后利⽤携带了通⽤序列的建库引物（携带index和测序引物）进⾏扩增后即完成了⽂库构建，
可以直接⽤于后续⼆代测序。
3）接⼒引物
雅思听力机经下载该技术的核⼼是Ω引物，引物是分为三部分，从5-3端依次是5端序列、Ω环和3端序列，其中5端序列和3端序列是和⽬标区段互补的，但是Ω环不是，这个环⾸先是通⽤序列（⽤于后续⽂库构建），其次这个环保证了扩增的特异性，减少引物⼆聚体和⾮特异性扩增。revolutionary
对于Ω引物，当5端和3端序列完全配对时才可以进⾏⽬标区段捕获，当5端配对⽽3端不是完全配对时其结构不稳定（因为Ω环存在），或导致引物3端脱落⽆法扩增，所以有效的减少了引物⼆聚体和⾮特异扩增。特异Ω引物进⾏⼀个循环（只进⾏⼀个循环，后续利⽤通⽤引物扩增，这样减少引物效率差异，增加均⼀性），利⽤Ω环的通⽤引物进⾏扩增建库。
最后利⽤两张图进⾏总结，⽐较明显的显⽰出杂交捕获、MIP和PCR⽅案的优缺点。
参考⽂献
Mamanova L, Coffey AJ, Scott CE, et al. Target-enrichment strategies for next-generation quencing.[J]. MLO: medical laboratory obrver, 2012, 44(6):26.
本⽂供稿：陈科
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