动物源奇异变形杆菌新德里金属β-内酰胺酶基因bla NDM
qq英语名字PCR检测技术规程
1范围
本文件规定了动物源奇异变形杆菌新德里金属β-内酰胺酶基因bla NDM PCR检测技术的术语和定义、检测原理、检测条件、检测方法和结果判定等。
本文件适用于动物源奇异变形杆菌新德里金属β-内酰胺酶基因bla NDM的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB19489实验室生物安全通用要求
3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
以下术语和定义适用于本文件。
3.1.1新德里金属-β-内酰胺酶（NDM）
新德里金属-β-内酰胺酶（NDM）是一种金属-β-内酰胺酶（MBL），能水解大多数β-内酰胺类抗生素（包括碳青霉烯类），但不包括单环内酰胺类（例如氨曲南）。碳青霉烯类抗生素是治疗由大部分革兰氏阴性菌引起的严重感染的主要抗菌药物，临床上可用的β-内酰胺酶抑制剂（包括阿维巴坦、克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦）不能抑制NDM水解活性。NDM-1在2008年首次从一名在印度新德里住院的瑞典患者身上分离出的肺炎克雷伯菌中被发现。目前已在肠杆菌科、不动杆菌和假单胞菌等多个物种中发现了NDM-1，并已鉴定出31种NDM变体。
3.1.2聚合酶链式反应（PCR）
聚合酶链式反应（可
PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，看作是生物体外的特殊DNA复制，其
最大特点是能将微量DNA大幅增加。PCR技术能够检测和鉴别同菌种不同基因型的菌株，跟踪耐药基因的转移和传播，是分子流行病学调查研究的基础方法。
3.2缩略语
以下缩略语适用于本文件。
smart意思SS：SS琼脂（Salmonella Shigella Agar）
BHI：脑心浸出液肉汤（Brain Heart Infusion Broth）
Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris(hydroxymethyl)aminomethane）
EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid）青岛英语培训学校
TBE：Tris-硼酸-EDTA缓冲液
TE：Tris-EDTA缓冲液
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world sing how learn4原理
通过对bla NDM基因的序列分析，利用Primer Premier6.0软件设计并合成了1对特异性引物，建立了动物源奇异变形杆菌新德里金属β-内酰胺酶基因bla NDM PCR检测技术规程。通过反复试验确定引物的最佳退火温度为55℃，该引物具有良好的特异性、稳定性和重复性。用所建立的方法对40株山东地区鸡源奇异变形杆菌中碳青霉烯类耐药基因bla NDM进行检测分析。pacemaker
5试剂与耗材
5.1美罗培南（MEM）
5.2SS琼脂（按照附录A.1配制）
5.3BHI肉汤（按照附录A.2配制）
5.41mol/L Tris-HCl，pH8.0（按照附录A.3配制）
5.50.5mol/L EDTA，pH8.0（按照附录A.4配制）
5.6TE缓冲液（按照附录A.5配制）
5.710×TBE电泳缓冲液（按照附录A.6配制）
weight是什么意思
5.8琼脂糖凝胶（按照附录A.7配制）
5.92×Taq Master Mix(Dye Plμs)
5.10DL2000Plμs DNA Marker
5.11阳性对照
5.12阴性对照
5.13Gold View核酸染料
5.14NDM特异性引物
颟顸5.15八连管
5.16离心管（6仪器与设0.2mL、1.5mL）
备
6.1立式高压蒸汽灭菌器6.2生化恒温培养箱
血库
6.3立式空气恒温振荡培养箱
6.4PCR 仪
6.5琼脂糖凝胶电泳仪
6.6凝胶成像系统
6.7微波炉
6.8微量移液器（2.5μL 、10μL 、100μL 、200μL 、1000μL ）
6.9冷冻离心机：离心力≥12.000g
6.10水浴锅
6.11电子天平：精度0.1g 、0.01g 、0.001g
7检测方法
7.1样品准备
将奇异变形杆菌直接划线于SS 琼脂平板（含有1μg/mL 亚胺培南），37℃孵育16-18h ，选择挑取单个黑色中心菌落接种至含1mL BHI 肉汤的1.5mL 离心管中。
7.2样品DNA 提取
将含1mL BHI 肉汤的1.5mL 离心管12,000rpm 4℃冷冻离心10min ，弃上清，加入200μL TE 缓冲液重悬沉淀，放入100℃沸水中煮至少10min ，取出后立即冰浴10min ，rpm 4℃离心5min ，取上清液即为样品DNA 。
7.3PCR 检12,000测
以提取的样品DNA 为模板进行PCR 反应，同时设置阳性对照（含NDM 耐药基因奇异变形杆菌提取的DNA ）、阴性对照（不含NDM 耐药基因奇异变形杆菌提取的DNA ）及空白对照（不含模板DNA ）。具体PCR 检测方法见附录B 。
8结果判定
有限公司 英文缩写8.1阳性对照经PCR 扩增反应后出现984bp 大小的条带，而阴性对照和空白对照不出现任何条带，试验结果成立，反之不成立。
8.2在试验结果成立的前提下，样品DNA 扩增出与阳性对照一致的984bp 条带，则说明菌株中存在NDM 耐药基因，否则说明不存在NDM 耐药基因。
9注意事项
采样及检测过程中应注意个人防护，戴口罩和手套、穿工作服：在无污染环境中操作，及时清理物品，用75%酒精对操作区域消毒处理，废弃物经高压灭菌后按有关规定处理。
