B2H 筛库与验证流程
一、准备重组pBT载体
1.构建BD重组载体
将片段连接到pBT载体上，转化应该选用XL1-Blue MRF‘KAN宿主菌（lacI q和卡纳抗性），培养时间为30度24小时。
以下为验证引物：
pBT forward primer 5'- TCC GTT GTG GGG AAA GTT ATC - 3'
pBT rever primer 5'- GGG TAG CCA GCA GCA TCC - 3'
2．pBT重组质粒的表达验证
将质粒与空载体转化到192菌株中，可以使用western blott分析蛋白是否表达，注意：蛋白表达量可能不高。
A.将重组菌涂板于LB（chl）平板上，30度培养24小时。
B.挑选单克隆接种于2mL M9 His-dropout（25ug/ml Chl）培养基中37度过夜摇美国大选结果时间
菌。1：100接种于新鲜的2mL M9 His-dropout（25ug/ml Chl+10uM IPTG）诱导蛋白表达。细胞OD值到达0.5-0.6。
C.取20ul与2xSDSloading buffer 混合煮沸后上样。利用WB验证其表达。3．准备重组pBT质粒DNA
利用含有pBT质粒的XL1-Blue MRF‘KAN进行质粒提取，采用低拷贝质粒提取方案（5-10copys per cell）.提取浓度保证到50ng/ul
公共英语三级报名
商务英语怎么学4. 验证载体自激活
为了验证自激活，重组pBT和pTRG共转化190菌，在选择培养基（5mM 3AT）上筛选，菌落数应该很少。
表1：共转换质粒组合
1.预热SOC培养基到42℃。
2.将190菌放冰上解冻，轻轻吹打混匀菌体。一旦解冻，转移100ul/份细胞到预冷
的14ml BD 管上。
3.加入1.7ul 巯基乙醇（菌株提供），轻轻摇菌。
4.冰上放置10分钟，两分钟轻摇一次
5.加入BD和AD质粒各50ng，轻轻摇匀。
6.冰上放置30分钟，15分钟后轻轻摇匀。
免费英文简历模板7.轻轻摇匀后立即42度热激35s
8.冰上放置2分钟。
9.加入0.9ml 预热的soc培养基。
10.37度225rpm恢复培养90分钟。
11.2000g离心10分钟收集菌体。
12.小心吸弃上清，加入1ml M9 His-dropout培养基
13.重复11部后加入新鲜的1ml M9 His-dropout培养基
14.37度 225rpm 培养2小时。（让菌株适应生长）
mission15.按上表进行涂板。无选择培养基时，用M9 His-dropout稀释100倍后分别用20ul
和200ul进行涂板。平板放置37℃培养24小时，如果克隆不明显，可置于避光室温下16小时，这能让含有毒蛋白和弱互作的细胞生长。
16.计算选择培养基与无选择培养基的菌落数量与转化效率。（菌落大小可能不同）
计算1：
17.判断重组pBT载体是否可用，如果不可用，尝试找出引起非特异性互作的区域。
jsp是什么意思
将这些区域修改后重新构建重组载体。
prescription
试剂与耗材：
Xbule感受态：2管；SOC培养基；M9-HisDo 培养基；非选择平板：15cm*2；选择平板：15cm*2
二、筛选互做蛋白
验证感受态效率
autofellatio1.预热SOC培养基到42℃。
2.将XL1-Blue MRF´ Kan菌放冰上解冻，轻轻吹打混匀菌体。一旦解冻，转移
we are young100ul/份细胞到预冷的14ml BD 管上。
3.加入2ul 巯基乙醇（菌株提供），轻轻摇菌。
4.冰上放置10分钟，两分钟轻摇一次（不超过10分钟）
5.加入PUC18质粒1ul（100pg），轻轻摇匀。
feel good6.冰上放置30分钟，15分钟后轻轻摇匀。
7.轻轻摇匀后立即42度热激33s
8.冰上放置2分钟。
9.加入0.9ml 预热的soc培养基。
10.37度225rpm恢复培养90分钟。
11. 吸取2.5ul菌液加入100ulsoc 培养基中，混匀后涂于LB–ampicillin平板上.
12. 30℃培养24h。（预期结果：250个克隆即转化效率为109cfu/ug pUC18 DNA.）表1：共转换质粒组合
预筛库流程
使用500ul 190感受态细胞来进行共转换筛库与阳性对照。
1.预热SOC培养基到42℃。
2.将190菌放冰上解冻，轻轻吹打混匀菌体。一旦解冻，转移100ul/份细胞到预冷
的14ml BD 管上。
3.加入1.7ul 巯基乙醇（菌株提供），轻轻摇菌。
4.冰上放置10分钟，两分钟轻摇一次
5.加入BD和AD质粒组合（pBT-LGF2+pTRG-gal，重组pBT+pTRG 文库）各
50ng，轻轻摇匀。
6.冰上放置30分钟，15分钟后轻轻摇匀。
7.轻轻摇匀后立即42度热激35s
