抗生素药敏试验标准操作程序
1 检验目的
规范药敏试验操作方法，保证药敏试验结果的准确、可靠。
2 普通细菌抗生素药敏试验
2.1 纸片扩散法标准操作程序
2.1.1 制备接种菌液： 用接种环挑取已分纯菌落， 悬浮于生理盐水中， 震荡混匀后与标准比浊管比浊 (0.5McFarland)，以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管相同。
2.1.2 接种平板：制备好的接种液必须在15分钟内使用。用灭菌的棉拭子蘸取菌液，在管壁上旋转挤压，去掉多余菌液，用拭子涂布整个培养基表面(三个方向， 每次将平板旋转 60 度， 最后沿平皿 周边绕两圈，保证均匀)。
2.1.3 贴纸片：半开平板的盖子，约 3~5 分钟(不可超过 15 分钟)，用镊子取纸片一张，贴在琼脂平板表面，用镊尖压一下，使其贴平，纸片一旦贴下就不可再拿起，因纸片中的药物已
扩散到琼脂中。每张纸片间距不少于 24mm，纸片中心距平皿边缘不少于 15 mm，或用纸片分配器按压。
2.1.4 孵育： 35℃孵箱孵育 18-24 小时后，读取结果。
2.1.5 判定结果：培养后取出平板，测量抑菌环的直径，根据 CLSI 标准判读结果。
2.1.6 质控程序 见《微生物室室内质控操作程序》。
2.2 仪器法标准操作程序
2.2.1 将鉴定/药敏板放在加样盘上。
2.2.2 在鉴定/药敏板上标记标本信息。
2.2.3 将 broth 试管放置在加样盘上; ID broth 放在左边；AST broth 放在右边。
2.2.4 用 ID broth 配置 0.5 McFarland 菌悬液。
a) 使用无菌棉签挑取菌落至 ID broth；
b) 混匀 5 conds.等待 10 conds 使气泡消失；
c) 使用 PhoenixSpecTM 比浊仪调整菌液浓度 (以 0.45-0.55 McFarland 为佳)。
2.2.5 在 AST broth 中垂直滴加一滴 AST indicator solution。
2.2.6 从 ID broth 中转移 25µl 菌悬液至 AST broth，颠倒混匀，请勿震荡。
2.2.7 将 ID broth 和 AST broth 分别倾倒入鉴定/药敏板。
2.2.8 用密封条将鉴定/药敏板封好。隔离霜的用法
2.2.9 检查每一个反应孔是否充满菌液以及是否具有气泡。
2.2.10 鉴定/药敏板信息输入:
a 按 键添加鉴定/药敏板信息；
b 使用条码扫描器扫描鉴定/药敏板的条形码,使仪器能识别鉴定/药敏板的类别；
c 若使用 Accession 条码,可用条码扫描器扫描,也可人工键入 Accession 号码；绯闻女孩 结局
d 输入isolate 数目,仪器默认值为 "1"；
e 按 键存盘。
2.2.11 结果出来后将自动传输至微生物室 LIS海上钢琴师经典台词 系统， 如仪器无法做出待检菌的鉴定和/或药敏结果或 部分药敏结果缺失， 可用手工方法补充。
2.2.12 质控程序 见《微生物室室内质控操作程序》。
2.2.13 注意事项
a 鉴定/药敏板启封后应在 2 hours 内使用。
b 在标记鉴定/药敏板时，勿影响到 ID/AST 检测孔。
c 在标记鉴定/药敏板时，使用无荧光的标记材料。
d 配置好的菌液必须在 60 minutes 内加样完成。
e 勿使用金属接种环。
f AST indicator solution 需在室温时使用。
g 若 AST indicator solution 加过多或过少，需丢弃 ASTpossiblely broth，另取一支 AST broth 重新滴加。
h 加过 AST indicator solution 的 AST broth 需在2 hours 内使用或在避光的室温环境中保持 8 hours 。
i 鉴定/药敏板加样时的角度非常重要, 鉴定/药敏板必须放置在加样盘上。
j 加样完成后鉴定/药敏板必须在 30 minutes 内放入仪器中检测。
k 在转移鉴定/药敏板时，请使用鉴定/药敏板转移容器，确保鉴定/药敏板保持直立状态。
l 避免将鉴定/药敏板掉落在地板上，导致反应孔交叉污染。
m 当输入鉴定/药敏板信息后，必须在 30 minutes 内将鉴定/药敏板放入仪器。
n 使用 键可重新输入信息。
2.3 E-test 法标准操作程序
2.3.1 接种菌液的准备和药敏平板的选择
与kinlan纸片扩散法药敏试验的要求和方法一样。
2.3.2 药敏平板的接种与 E-test 纸条的放置。
将配置好的被测试菌液用无菌棉签均匀涂布在相应药敏平板上，用镊子将药敏试条放置在上面，试条的刻度面朝上，并与琼脂平板紧密接触(可用镊子轻压以驱赶下方的气泡)，药物最高浓度处应 靠平板边缘，试条一旦贴上琼脂表面就不能再移动。
2.3.3 培养 接种后的平板按相应的培养要求，放入孵箱培养 18~24h，观察结果。
2.3.4 结果判读：经孵育后，围绕 E-test 纸条可形成一个椭圆形的抑菌圈，在抑菌圈与试纸条的横切相交处，试纸条上的刻度即是测定抗生素对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)。同时结合 CLSI 标准判 读结果。
2.3.5 判断结果时的注意事项：
a 对于肺炎链球菌的药敏，应仔细排除所有微小菌落，可倾斜平板或用放大镜观察。
b 对于溶血性细菌的药敏，应忽略溶血，读取生长物完全被抑制处。
c 对于凝固酶阴性葡萄球菌的药敏，因其终点有拖尾现象时表示有对该抗生素的耐药亚群存在，忽略拖尾现象。
d 与药物有关方面的注意事项，如β - 内酰胺酶抑制剂由于内源性活性，常将椭圆环延伸到 IC 之下 (下凹)，应根据上方曲线弧度推测其与试条交点处。
2.3.6 质控程序见《微生物室室内质控操作程序》。
3 特殊菌的抗生素敏感实验法
3.1 肺炎链球菌药敏试验 (非脑膜炎分离株)
3.1.1 培养基：M-H 琼脂加 5%的脱纤维羊血。
3.1.2 从非脑膜炎分离株，先用 1p g/片的苯唑西林纸片筛选试验测定青霉素的敏感性，当
苯唑西林的抑provinces菌环直径≤19mm 时，需用 E-test 法测定进行青霉素的 MIC 值，根据 CLSI 标准判读结果。
3.2.3 质控菌：肺炎链球菌 ATCC49619。
3.2 肺炎链球菌药敏试验 (脑脊液中分离株： E-test 法)
3.2.1 从脑脊液分离出肺炎链球菌时， 应直接用 E-test 法进行青霉素的 MIC娘娘腔英文 测定。根据 CLSI标准判读结果。
3.2.2 质控菌：肺炎链球菌 ATCC49619。
3.3 流感嗜血杆菌药敏试验
3.3.1 培养基： 用 HTM 琼脂.。
3.3.2 方法：挑选从隔夜孵育(35℃,5%~7%CO2 环镜下)生长于巧克力琼脂平板上菌落，混悬于肉汤中， 调整浓度至 0.5 号麦氏标准浊度管， 用棉拭子浸菌液直接涂布在 HTM 琼脂平板表面，孵育于 35℃，COforgotten2 环境下，测量抑菌环直径大小，参照 CLSI 标准解释。
3.3.3 质控菌：流感嗜血杆菌 ATCC10211。
3.4 淋病奈瑟菌试验
3.4.1 培养基：加 5%脱纤维羊血的巧克力 M-H 琼脂平板。
3.4.2 方法：直接从过夜培养的巧克力琼脂上挑选菌落，混悬于肉汤中，调整浓度至 0.5 号麦氏标准 比浊管，用棉拭直接涂布于含 1%生长补充剂 GC 平板，贴好纸片后，置 3%~5%CO2 环镜下， 35℃ 孵育 20~24 小时。
3.4.3 质控菌：淋病奈瑟氏菌 ATCC49226。
3socksonline.5 草绿色链球菌
3.5.1 分离于无菌部位的草绿色链球菌 (如 CSF、血液，骨髓等)，应直接用 E-test 法进行青霉素或美罗培南的 MIC 测定，根据 CLSI 标准判读结果。
3.5.2 质控菌：肺炎链球菌 过去将来时ATCC49619。
