分子植物育种实验室方法(二)
M ETHODS IN LAB OF M OLECULAR PLAN T BREEDING(2)
PCR技术及实用方法
郑景生1,2 吕蓓1
1海南省农作物分子育种重点实验室，三亚,572025
2福建省农业科学院稻麦研究所，福州,350019
摘要
皮肉骨本文系统介绍了PCR技术的原理，反应组分、反应程序及PCR产物的电泳检测方法。这些实用的PCR方法大都来源于国内外一些著名的实验室并经海南省农作物分子育种重点实验室改进而成。这些方法作为分子植物育种实验室的技术平台具有非常好的实用性，能满足常规的分子生物学及生物工程技术研究的要求。
关键词
PCR技术，分子植物育种
PCR Technique and its Practical Methods
Zheng Jingsheng1,2 LǜBei1
1Hainan Provincial Key Laboratory of Crop M olecular Breeding,Sanya,572025
2The Institute of Rice&w heat,Fujian Academy of Agricaltural S ciences,Fuzhou,350019
ABST RACT树仁大学
This paper introduced PC R principles,reaction components,reaction prog rams and electrophoresis detecting techniques.All of the practical protocols were derived from m any famous domestic and international laboratories and modified by H ainan Provincial Key Laboratory of Crop Molecular Breeding(HiCM BL).It has more beneficial to adapt tho protocols as technology platfo rm in the lab of molecular plant breeding due to its good practicability,which could meet the demands of the rearches in fields of molecular biology and biotechnology.
K EYWO RDS
PCR,Practical method,M olecular plant breeding
1前言
PCR，聚合酶链式反应(Polymera Chain Reaction,PC R)是1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Kary Banks Mulis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。这项新技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的某些特点，实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增，可在短时间内在试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。PCR技术操作简便、结果可靠，并被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析，对分子生物学的发
分子植物育种,2003年，第1卷，第3期，第381—394页M olecular P lant Breeding,2003,V ol.1,No.3,381—394
展产生了革命性的影响。发明人Kary Banks M ulis 也因此荣获1994年度诺贝尔化学奖。
PCR 技术的原理是:DNA 聚合酶以单链DNA 为模板，借助一小段双链DNA 来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下,DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3'-OH 末端，并以此为起始点，沿模板5'※3'方向延伸，合成一条新的DNA 互补链。PC R 反应的基本成分包括：模板DNA (待扩增DNA )、引物、4种脱
氧核苷酸(dN TPs )、DNA 聚合酶和适宜的缓冲液。PCR 反应中，通过双链DNA 的高温变性(denaturation )、引物与模板的低温退火(anneal -ing )和适温延伸(extension )这三步反应反复循环。每一循环中所合成的新链，又都可作为下一循环中的模板。PCR 合成的特定的DNA 序列产量随着循环次数呈指数增加，从而达到迅速大量扩增的目的。
2PCR 反应基本成分
2.1模板DNA
PCR 反应的模板可以是单链或双链DNA ，可以是基因组DNA 或cDNA ,mRNA 也可作为PCR 的模板，只需用逆转录酶把m RNA 逆转录为cD -NA 即可。由于PCR 反应的特异性由寡聚核苷酸引物决定，模板DNA 不需要高度纯化，但应避免任何蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂、能结合DNA 的蛋白质及多糖类物质的污染。选用纯化的DNA 做模板，可增加模板分子的浓度，除去可能抑制PCR 反应的杂质如SDS 会严重抑制Taq DNA 聚合酶的活性，可显著提高PCR 扩增的有效性。通常，模板DNA 保存于10mmol /L Tris -HCl (pH7.6)、0.1mmol /L EDTA (pH8.0)缓冲液中。
PCR 所需模板DNA 的量极微(通常在纳克级范围内)，通常适宜的模板DNA 浓度为30-50ng ，不到1纳克的基因组DNA 序列就足以用来进行PCR 分析，甚至用1个DNA 分子就能扩增出特定的DNA 序列。利用PC R 技术可以从石蜡包埋40多年的宫颈癌活检组织中检测出人乳头瘤病毒(HPV )DNA ，可以用
多年前的血斑分析苯丙酮尿症，甚至从几千年的埃及木乃伊中分离出来的
DNA 也可用作PCR 反应的模板。
2.2引物
PCR 引物是一段与待扩增的目标DNA 序列侧翼片段互补的寡核苷酸片段，长度大多为10-30个碱基。通常，一对引物包含5'端与正义链互补的寡核苷酸片段和3'端与反义链互补的寡核苷酸片段，这两个寡核苷酸片段在模板DNA 上的结合位置之间的距离决定PCR 扩增片段的长度。
根据统计学计算，长约17个碱基的寡核苷酸序列在人类基因组中可能出现的概率为1次。因此，只要引物不少于16个核苷酸，就能保证PC R 扩增序列的特异性。引物过长往往会降低其与模板的杂交效率，从而减低PCR 的反应效率。PCR 反应成功的关键是设计最佳的引物。引物设计的先决条件是与引物结合的靶DNA 序列必须是已知的，与两个引物结合的序列之间的靶DNA 序列则未必清楚。设计引物时应尽可能选择碱基随机分布的序列，尽量避免多嘌呤、多聚嘧啶或其他异常序列。两个引物中G +C 碱基对的百分比(G +C %)应尽量相似，若待扩增序列中GC 含量已知时，引物的GC 含量则应与其类似。一般情况下，设计引物时,G +C 碱基对含量以40%-60%为佳，解链温度(melting temperature ,Tm )高于55℃。避免引物自身形成发夹结构等二级结构，尤其是。两个引物之间不应存在互补序列，尤其是在引物的3'末端，即使无法避免，其3'端的互补碱基也不能多于2个，以减少“引物二聚体”的形
成。否则会影响靶DNA 序列的扩增。在合成新链时,DNA 聚合酶将单核苷酸添加到引物的3'末端，因此引物3'端的5-6个碱基与靶DNA 片段的配对必须精确、严格。school怎么读
简并引物是由多种寡核苷酸片段组成的混合物，彼此间有一个或数个核苷酸差异。简并引物的设计是通过对氨基酸序列或对相关基因的同源序列的推测进行的(陆德如等,2002)。通常一条引物中的简并碱基不能超过4处，简并碱基数过多，会造成反应体系中有效引物量相对较少，而增加引物的使用量，易引起非特异性扩增。简并引物与模板错配产生的非特异扩增可通过提高退火温度或“热起动”方法来克服。
shelly什么意思由于引物设计涉及的因素较多，因此常场借助PCR 引物设计软件如PCGENE 、DNAM an 进行辅助设计，然后由专业的生物技术公司用DNA 合
382 confliction
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M olecular Plant Breeding
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成仪合成。合成的寡核苷酸引物一般用层析法或聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯化，纯化的引物在25%乙腈溶液中4℃下短暂保存或在-20℃下中长期保存，冻干后则可保存1-2年以上。
在PCR反应中，引物的适宜浓度为0.1-1 (mol/L。引物浓度过高，容易形成非特异性扩增，引物浓度过低，不足以完成30个循环，降低PCR 的产量。通常模板DNA的量较多或高度复杂DNA(High complexity DNA)如人类基因组DNA 作模板时，引物浓度应低一些；模板DNA的量较少或低度复杂DNA(Low complexity DNA)如质粒DNA作模板时，引物浓度应高一些。
在分子植物育种实验室中常用的RAPD引物、ISS R引物及SS R引物等一些通用引物均可向专业的生化与分子生物学试剂公司购买，如Promeg a 公司或Invitrogen公司等。
2.3dNTPs
dNTPs(dATP、dCTP、dGTP和dT TP)是PCR反应中靶DNA序列扩增的原料。在PC R反应中每种脱氧核苷三磷酸的浓度以50-200μmol/ L为宜，不能低于10-15μmol/L。浓度过高易引起非特异性PCR产物，当dNTP浓度高于50m mol/L时还会抑制Taq酶的活性；浓度过低则影响扩增产量。4种dN TP的摩尔浓度应相同，不平衡的浓度会导致碱基错配率上升，降低合成速度，导致反应过早终止。在100μl的标准反应体系中，浓度50μmol/L和200μmol/L的dNTP就足以分别合成6.5μg和25μg DNA。
本实验室常用的dN TPs购自Promega公司。贮存液的浓度为25m mol/l dNTPs混合液，其配制方法是将购自厂商的4种核苷酸等量混合。
2.4DNA聚合酶
最初的DNA聚合酶是从大肠杆菌中提取的DNA聚合酶I的Klenow片段。该片段具有聚合酶活性和3'※5'外切核酸酶活性，能识别和消除错配的引物末端，以校正复制过程中错配的核苷酸。但Klenow片段对热敏感,DNA变性温度即可使酶失活，因此在PCR的变性步骤后都必须重新加聚合酶，造成PCR技术操作十分烦琐、耗时费力、反应低效及费用增加。
后来，从美国黄石国家公园的温泉中发现的嗜热菌—水生栖热菌(Therm us aquatic s,Taq)中分离出了分子量为60-68kDa，比活性为2,000 -8,000U/m g的DNA聚合酶。以后又分离出分子量约为94kDa，比活性为200,000U/mg的的DNA聚合酶，该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸。由于这些聚合酶具有95℃以上的耐热性，只需在PCR反应开始时加一次聚合酶，就能在整个PCR循环中保持酶活性，大大简化了PCR操作程序，提高了PCR扩增效力、省时省力，从而使PCR技术得到了进一步完善。目前，商品化的Taq DNA聚合酶均为基因重组技术生产并在PCR反应中广为应用。
由于水生栖热菌在70-75℃下最适生长，因此72℃被认为是Taq DNA聚合酶(94kDa)合成DNA的最适温度，每个酶分子与核苷酸的结合率每秒近150个核苷酸。在高温条件下,Taq DNA 聚合酶仍然具有较高的酶活性，不会发生不可逆变性。在92.5℃、95℃和97.5℃时,PCR反应中的Taq DNA聚合酶分别经过130min、40min和5-6min后仍可保持50%左右的酶活性。因此在实际操作时选用的变性温度以92-94℃较为适宜，不宜高于95℃。
在100μl的PCR标准反应体系中,Taq DNA 聚合酶的常用浓度为1-2.5U，人类基因组DNA 作模板时,Taq DNA聚合酶的适宜浓度范围为1-4U。酶量过多会导致增加非特异性PCR产物，反之会引起PCR产量不足。Taq DNA聚合酶作用时需要Mg2+，每次扩增反应必须确定最佳Mg2+浓度。
由于Taq DNA聚合酶没有3'※5'外切核酸酶活性，缺乏校正错配核苷酸的能力，通常错配率约为2×10-4。在一般情况下这一错配率并不是一个严重的问题，因为错配产物在PCR总产物中所占比例仍然很小。但当PC R产物如用于克隆研究时，含有错配核苷酸的产物会导致所有克隆DNA 都会带有相同的错配(突变)。在这种情况下，减低错配率是非常重要的。通过增加模板分子，减少循环次数和减低DNA合成的总量可减少PC R 反应中错配产物的形成，或者使用高保真酶Pfu DNA聚合酶。
Pfu DNA聚合酶是一种具有高保真性能的高温DNA聚合酶，来源于高温嗜热菌Pyrococcus furiosis，分子量为90kDa，适用于一般的PCR反应、基因克隆与表达、基因突变分析、全基因合
PCR技术及实用方法
PCR T echnique and its P ractical M ethods
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成等。Pfu 酶具有5'※3'的DNA 聚合酶活性，还具有3'※5'的外切酶活性，无5'※3'的外切酶活性(保真
性)，其PCR 产物为平未端，扩增速度为600bp /min ，最佳延伸温度为65-75℃,dNTP 的工作浓度为100-300μmol /l ，最佳M g 2+为2-3mmol /l ，最佳pH 值为8.1-9.1，酶浓度为5U 。与Taq 酶相比,Pfu 酶扩增效率通常比Taq 酶略差，这是由的Pfu 酶的3'※5'的外切酶活性(高保真)引起的，并非Pfu 酶的质量不稳定。用Pfu 酶扩增时，引物的纯度要求较高，长度要求大于18bp ,Tm 在55-58℃之间，引物的浓度在0.1-0.5μmol /l 之间，比Taq 酶略高。由于Pfu 酶具有3'※5'的外切酶活性可能会降解引物(特别是溶液中没有dNTP 的情况下)，因此Pfu 酶必须是最后加入到反应中，并立即进行PCR 反应。Pfu 酶的热稳定性比Taq 酶高。对于GC 含量很高的模板变性温度可提高到98℃，而不会影响Pfu 酶的活性。由于Pfu 酶的PCR 产物为平未端，不能直接进行T /A 克隆，因此可在PCR 产物加3'-A 后再进行T /A 克隆或进行平未端连接。在100μl 标准反应体系中加5UPfu 酶。目前,Pfu 酶被公认为取代Taq 酶的首选高保真高温DNA 聚合酶。除Taq DNA 聚合酶、Pfu DNA 聚合酶外，常见的DNA 聚合酶还有:Tth DNA 聚合酶：具有5'※3'聚合酶活性和5'※3'外切酶活性，适合于反转录、PCR 及RT -PCR ;Tfl DNA 聚合酶：具有5'※3'聚合酶活性和5'※3'外切酶活性，在高温下半衰期较长，适合于PCR 、DNA 测序和高温下引物延伸;Tli DNA 聚合酶：具有5'※3'聚合酶活性和3'※5'校正活性，适合于高保真PCR ;Platium Pfx DNA 聚合酶：具有5'※3'聚合酶活性和3'※5'校正活性，带有耐热的Taq DNA 聚合酶抗体，适合于长片段PCR 、高保真PC R 及热启动PCR ;Platium DNA 聚合酶(高保真)：具有5'※3'聚合酶活性和3'※5'校正活性，带有耐热的Taq DNA 聚合酶抗体，适合于长片段PCR 、高保真PCR 及热启动PCR 。
2.5缓冲液
PCR 反应的标准缓冲液通常含有10mmol /LTris -HCl (pH8.3),50mmol /LKCl 和1.5mmol /L MgCl 2。这种标准缓冲液在72℃温育时，反应体系的pH 值会下降1个多单位，使缓冲液的pH 值接近7.2(金冬雁等,1999)，基本适用于各种模
板、寡核苷酸引物，但对某种模板与引物的特定
组合就不一定最佳，用时需再作适当调整(Kraw etz et al .,1989)。一般购买的10×PCR 缓冲液分含M g 2+和不含Mg 2+两种，不含Mg 2+的缓冲液，其25mmol /l MgCl 2单独包装或需另行购买，使用时再自行配制。本实验室常用无Mg 2+10×PCR 缓冲液贮备液为0.1mol /L Tris -HCl (pH8.0),0.5mol /lKCl 及1%Triton R X -100。
2.6M g 2+及其它成分
PCR 反应体系中Mg 2+的浓度十分重要，适宜的M g 2+浓度为高于dNTP 总浓度0.5-2.5mmol /L 。当dN TP 浓度为0.2mmol /L 时，建议M g 2+
的
浓度为1mmol /L 。M g 2+
浓度过高，容易生成非
特异性扩增产物；反之，浓度过低会使PCR 产量
分手快乐英文降低。M g
2+
的有效浓度受到高浓度的螯合剂如
EDTA 、高浓度的带负电荷离子基团如磷酸根的影响，它们可与M g
2+
结合从而降低M g
2+
的有效浓度。因此，每当首次使用靶序列、引物、dNTP (含磷酸根)的新组合时，都要将Mg
2+
浓度调至
最佳。通常的方法是设置一组反应，每一反应的KCL (50mmol /L )和Tris -HCl (10mmol /L )浓度相同，而MgCl 2浓度不同(0.05-5mmol /L ，每次增加0.5m mol /L )，反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来比较各反应扩增产物的量，从中选出最佳的Mg 2+浓度(金冬雁等,1999)。
常用的M g 2+为六水氯化镁(M gCl 2·6H 2O )，可向Sigm a 等公司购买，由于MgCl 2极易潮解，应选购小瓶装，启用后勿长期存放。本实验室通常选用20mmol /l Mg Cl 2，其贮备液的配制为称4.066g 六水氯化镁，先加800m l ddH 2O 溶解，最后定容至1L ，分装后高压灭菌备用。
在早期用Klenow 酶的PCR 反应中常要加入10%的二甲亚砜(DMSO )，它有利于减少DNA 的二级结构，使GC 含量较高的模板易于完全变性。使用Taq DNA 聚合酶的PCR 反应中，一般都不用DMSO ，因为DM SO 对Taq DNA 聚合酶有轻微的抑制作用，会降低扩增产物的总产量。也有研究表明，加入DM SO 对某些PCR 反应有促进作用。
为防止PCR 反应过程中反应液体的蒸发，常在反应物上面加一滴矿物油覆盖，以维持反应体系的浓度和热恒定，能保证PCR 反应的有效性并
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分子植物育种
M olecular Plant Breeding
日语级别增加扩增产量。
3PCR反应程序参数
PCR反应程序参数(即循环参数)是指PCR 循环中每一反应步骤的温度、时间和循环次数。PCR扩增是通过变性(denaturation)、退火(an-nealing)和延伸(extension)三个步骤反复循环来实现的。因此，确定正确的PC R反应程序参数是PCR成功的保证。
3.1变性温度和时间
变性的目的是要使双链DNA完全解链成单链。原则上变性步骤要高温、短时，既要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。若变性不充分,DNA双链会很快恢复,PCR产物就会明显减少；反之，变性温度过高、时间过长，会加快酶的失活。典型的变性条件是95℃，时间30秒，对GC含量多的靶DNA序列宜用较高的变性温度。在解链温度(Tm)下,DNA的变性仅需几秒钟。Tm值可根据靶DNA中G+C含量，按公式Tm=81.5-16.6lg[Na+]+0.41(G+ C)%-600/N来计算，其中N为链长(金冬雁等,1999)。模板DNA或PC R产物的变性不完全，是PCR反应失败最常见的一个原因。
3.2引物退火温度和时间
退火的作用是使模板DNA单链或上一轮的反应产物与引物相结合。退火温度是指引物与模板特异结合的最佳温度，是任何PCR反应最重要的参数。引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应成分中的浓度。通常退火温度比引物的解链温度(Tm)低5℃，一般用37-55℃或高一点，时间1min。通常退火温度越高, PCR扩增特异性越好(陆德如等,2002)。估算Tm的方法是：引物为20个碱基以下时,Tm= 2℃×(A+T)+4℃×(G+C)；引物为20个碱基以上时,Tm=81.5+0.41(G+C)%-600/ L，其中L为引物长度。如GC含量约50%、长20个碱基的典型寡核苷酸引物的最佳退火温度为55℃。
3.3引物延伸温度和时间
引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到引物3-OH末端，依据模板序列合成一条互补新链的过程。引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。如用Taq DNA聚合酶，一般用70-75℃。在72℃时,1min延伸时间足以合成2kb的序列。延伸时间取决于靶序列的长度、浓度和延伸温度，一般为1-3min。靶序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间越长；反之，所需的延伸时间越短。在相同的延伸温度下，循环早期因靶序列即酶的底物浓度低，延伸时间要长些。在循环后期，当PC R产物的浓度超过酶的浓度(1nmol/L)时，酶被底物饱和，为了增加酶的周转利用，延伸时间也要长些。一般每1kb碱基的序列，延伸1min即可。对于扩增100-300个碱基的短序列片段，省去延伸温度
这一步骤而采用快速简便的变性、退火双温循环也是实验中常见的。因为Taq DNA聚合酶即使在变性温度下仍保持很强的酶活性，而延伸过程可在退火温度转变为变性温度的过程中完成。
在设定上述参数时，还应考虑所用PCR仪从一种温度转变到另一种温度所需的过渡时间，反应离心管管壁的厚薄而造成的管内温度滞后情况。
3.4循环次数
DNA双链高温变性、引物退火和新链延伸这三个步骤反复循环的次数通常需要25-40个。若PCR反应中各项参数适宜，其适宜的循环次数主要取决于靶DNA的起始浓度。表1显示了一个标准反应中不同靶分子数所需的适宜循环次数。循环次数过多，产物相应增多，但会增加非特异性产物的量及其复杂度；循环次数过少，会降低PCR产量。
表1 不同靶分子数所需的适宜循环次数
T able1Optimum cycling number of different targe t DNA molecules
靶分子数
No.of target DNA molecule
循环次数
Cycling number
3×10525-30
5×10430-35
1×10335-40
5040-45
clone
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