酿酒酵母胞内代谢关键酶对乙醇的耐受性keep you head down
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聂好;董亮;侯德文;李明达;王晓丹;赵长新
【摘 要】The activity of Gluco-6-phosphate dehydrogena, pyruvate kina, isocitrate dehydrogena, malate dehydrogena, ethanol dehydrogena and isocitrate lya in the EMP pathway and TCA cycle were detected in the medium with 2 %, 4%, 6 %, 8 % ethanol to analyze the tolerance of key metabolic enzymes on ethanol in the vivo cell of Saccharomyces cerevisiae. The results show that gluco-6-phosphate dehydrogena activity was incread by 23. 65% when adding 8% ethanol; the activity of pyruvate kina and alcohol dehydrogena was decread by 77. 7% and 62.72% when adding 2% ethanol, and the activity of isocitrate dehydrogena is only 0.003 U; malate dehydrogena and isocitrate lya activities were incread by 256.25% and 276.16% when adding 8% concentration of ethanol.%分别添加2％、4％、6％、8％乙醇的酵母细胞糖酵解途径和三羧酸循环中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、丙酮酸激酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、异柠檬酸裂解酶活力等关键代谢节点处的酶活力,以期考查关键酶对酒精
的耐受性.实验结果表明,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶对酒精的耐受能力较强,添加8％乙醇时的酶活力较无乙醇时提高23.65％；丙酮酸激酶、异柠檬酸脱氢酶和乙醇脱氧酶表现出对酒精的耐受力较差,丙酮酸激酶和乙醇脱氢酶在添加2％乙醇时的酶活力较无乙醇时分别降低77.7％和62.72％,异柠檬酸脱氢酶在添加8％乙醇时的酶活力仅为0.003 U；苹果酸脱氢酶和异柠檬酸裂解酶表现出对酒精良好的耐受性,在添加8％乙醇时的酶活力较无乙醇时分别提高256.25％和276.16％.
【期刊名称】《大连工业大学学报》
【年(卷),期】2011(030)005
【总页数】4页(P318-321)
【关键词】酿酒酵母;酶活力;乙醇;耐受性
【作 者】聂好;董亮;侯德文;李明达;王晓丹;赵长新
【作者单位】null 是什么意思大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034;大连工业大学生物工程学院,辽清华大学自主招生简章
宁大连 116034;华润雪花啤酒(盘锦)有限公司,辽宁盘锦 124010;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034
【正文语种】中 文
【中图分类】TS261.1;Q932
0 引 言
酵母菌株对浓度较大的乙醇的耐受性存在明显的差异[1],而其耐酒精的生化机理对于提高工业发酵生产酒精和研究酵母抵抗不良环境生命机制有着重要的理论和实际意义,近几年来科研工作者从自然界中分离得到或通过遗传工程手段构建了一些能在短时间内产生高浓度酒精(发酵液中的乙醇体积分数达到17.5%以上,而普通酵母菌只能产生9%～11%乙醇)的酵母菌,同时开展了大量的酵母菌耐酒精的生化机制的研究工作,发现酵母菌耐酒精的生理机理是十分复杂的[2-4]。细胞中的许多组分与酵母菌耐酒精能力有密切的关系,并且细胞的许多基因控制着酵母菌耐酒精的特性,而且这些具体生化机理还有待于进一步研究[5-6]。
本文以酶学研究为切入点,通过对不同酒精体积分数下的酵母细胞糖酵解途径和三羧酸循环中关键代谢节点处的关键酶进行分析,关键酶活力的变化一定程度上反映了其对酒精的耐受能力,为酵母对酒精耐受的生化机理研究提供了一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 菌 种bondage
酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae FCC 2146,由大连工业大学生物与食品学院保藏所提供。
1.1.2 培养基新东方网
YPD培养基(100 mL):蛋白胨2 g,葡萄糖2 g,酵母提取粉1 g,pH 6.0,0.1 MPa,115 ℃,灭菌20 min。
供试培养基是在此培养基中添加一定量的乙醇。
①YPD对照；②YPD+2 mL乙醇；③YPD+4 mL乙醇；④YPD+6 mL乙醇；⑤YPD+8 mL乙醇。
1.1.3 仪 器
TGL-16G台式离心机,上海安亭科学仪器厂；B-22M超高速冷冻离心机,Thermo IEC公司；全温落地式摇床,上海精宏仪器设备有限公司；JY99-2D超声波细胞粉碎机,宁波新芝科器研究所。
1.2 方 法
1.2.1 酵母培养
发酵培养:按体积分数2%的接种量接种于上述①、②、③号培养基中,在500 mL锥形瓶装液150 mL,30 ℃、230 r/min下在往复式振荡摇床培养24 h。定时无菌操作取10 mL发酵液维素酯滤膜进行真空超滤用于分析。
汽车点火线圈
种子培养:菌种复壮后,挑取1菌环酵母置于含有50 mL无菌YNB液体培养基的250 mL锥形瓶中,在30 ℃、160 r/min下振荡培养24 h,制备正处于指数生长期的细胞悬浊液。
1.2.2 酶活力检测意思
在YPD培养基中添加乙醇体积分数分别为2%、4%、6%、8%。接入S.cerevisiae连续培养,在它们各自的对数期取样,测定中间代谢途径中的一些关键酶活性随乙醇的变化,并绘制变化曲线。包括磷酸戊糖途径(6-磷酸葡萄糖脱氢酶,G6PDH),糖酵解途径(丙酮酸激酶,PYK),柠檬酸循环(苹果酸脱氢酶,MDH；异柠檬酸脱氢酶,ICDH；异柠檬酸裂解酶,ICL)以及乙醇脱氢酶YADH活性。丙酮酸激酶按参考文献[7]的方法测定,异柠檬酸脱氢酶按参考文献[8]的方法测定,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶按参考文献[9]的方法测定,苹果酸脱氢酶按参考文献[10]的方法测定,乙醇脱氢按酶参考文献[11]的方法测定。酶活力单位的定义为每分钟每毫克蛋白质转化1 μmol底物所需要的酶量为1个活力单位(U)。
2 结果与讨论
2.1 丙酮酸激酶对乙醇的耐受性分析
ext由图1可以看出,丙酮酸激酶活力随着乙醇体积分数的增加而减小。在不添加乙醇条件下,酵母细胞内丙酮酸激酶活力最高为0.682 U；在乙醇体积分数8%时,酵母细胞内丙酮酸激酶活
汉语四六级考试力最低为0.022 U。而在乙醇体积分数2%时,酵母细胞内丙酮酸激酶活力为0.152 U,较无乙醇的酶活力降低了77.7%。说明丙酮酸激酶活力对乙醇体积分数变化较为敏感,耐受性比较差。PYK活性提高有利于糖酵解途径进行的顺利,反之该酶活性降低会导致细胞能量的供应受到影响。它在细胞内含量的多少反映了细胞内流经糖酵解途径的通量大小。
图1 丙酮酸激酶活力随乙醇体积分数变化曲线Fig.1 Effect of different ethanol concentration on pyruvate kina activity
2.2 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶对乙醇的耐受性分析
由图2可见,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力随着乙醇体积分数的增加而略有增加。在无乙醇添加的培养条件下,酵母细胞内丙酮酸激酶活力最低为0.148 U；在乙醇体积分数8%时,酵母细胞内丙酮酸激酶活力最高,为0.183 U,较无乙醇条件下酶活力提高了23.65%,由此可知,乙醇体积分数的增加对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力的影响较小,耐受性较强。综上说明,随着乙醇体积分数的增加,酵母细胞内的PP途径也相应地增大,以提供大量的NADPH还原力以减轻乙醇对细胞的毒害作用。
图2 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力随乙醇体积分数变化曲线Fig.2 Effect of different ethanol concentration on gluco-6-phosphate dehydrogena activity
2.3 苹果酸脱氢酶对乙醇的耐受性分析
由图3可见,苹果酸脱氢酶活力随着乙醇体积分数的增加而增加。在无乙醇添加的培养条件下,酵母细胞内苹果酸脱氢酶活力最低为0.032 U；在乙醇体积分数8%时,酵母细胞内苹果酸脱氢酶活力最高为0.114 U,较无乙醇条件下酶活力提高了256.25%。从图3中可以看出,当乙醇体积分数高于4%时,苹果酸脱氢酶活力升高较为显著,由0.045 U升高至0.106 U。由此可知,乙醇体积分数的增加能够增加苹果酸脱氢酶的活力,苹果酸脱氢酶对乙醇的耐受性较强,当胞外乙醇体积分数超过4%时,苹果酸脱氢酶活力较高,TCA循环中该酶所催化的代谢反应较为活跃。
图3 苹果酸脱氢酶活力随乙醇体积分数变化曲线Fig.3 Effect of different ethanol concentration on malate dehydrogena activity
