自噬抑制剂氯喹对急性酒精诱导小鼠肝损伤的影响
桑文华;曾美纯;陈莎;陈然;范小芳;龚永生;张海邻;张宏宇;孔晓霞
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【摘 要】目的:探讨自噬抑制剂氯喹(CQ)对急性酒精诱导肝损伤的影响及其作用机制.方法:将雄性C57BL/6小鼠随机分为3组:正常对照组、酒精组、氯喹干预组(n=7),其中酒精组按4.5 g/kg剂量给予33％(V/V)酒精灌胃. HE和油红O染色检测各组小鼠肝组织脂滴变化;检测肝组织甘油三酯(TG)含量变化;检测血清谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性;免疫荧光法检测微管相关蛋白轻链3(LC3)蛋白变化;Western blot法检测LC3蛋白和核蛋白P65表达的变化;EHSA法检测促炎因子TNF-α、IL-6的变化.结果:与对照组比较,酒精组脂滴形成、TG含量、血清AST和ALT活性明显增高.与对照组比较,酒精组LC3-Ⅱ蛋白表达明显增加;与酒精组比较,氯喹干预组使酒精诱导的LC3-Ⅱ蛋白表达增强进一步加剧,使酒精诱导的TG含量、血清AST和ALT活性进一步增高,同时增加了酒精诱导的p65入核及TNFα、IL-6释放.结论:急性酒精能引起小鼠肝脏脂肪变化及炎症,而自噬抑制剂氯喹抑制自噬进程,加剧酒精诱导的肝损伤,说明自噬在酒精诱导肝损伤中可能具有保护效应.%Objective:To investigate the role of autophagy inhibitor chloroquine (CQ) in acute ethanol-induced liver injury and its mechenis
m.Methods:Twenty-one C57BL/6 male mice were randomly divided into three groups:control group,ethanol group,CQ + ethanol group (n =7).Mice in ethanol group were administered 33％ (v/v) ethanol at a do of 4.5 g/kg body weight.Ethanol-induced liver steatosis in each group was detected by hematoxylin and eosin staining.Hepatic lipid accumulation was detected by staining with Oil red O.Hepatic tissue triglyceride (TG) levels,rum aspartate aminotransfera(AST) and alanine aminotransfera(ALT) were determined by biochemical assays.Protein expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3(LC3) and nuclear factor κB p65(NF-κB p65) were measured by Western blot and immunofluorescence.Pro-inflammatory factors tumor necrosis factor-α(TNF-α) 、interleukin 6(IL-6) were detected by ELISA.Results:Compared with control group,ethanol induced liver injury proved by accumulation of hepatic lipids,TG levels,AST and ALT activities were significantly incread by ethanol,protein expression of LC3-Ⅱ was also markedly incread by ethanol.Compared with ethanol group,addition of CQ incread furtherthe level of LC3-Ⅱ expression,and TG amount,rum AST and ALT activities,and the expression of NF-κB p65,TNF-α and IL-6.Conclusion:Acute ethanol-intake could indu
ce liver steatosis and inflammation,and autophagy inhibitor CQ exacerbatedethanol-induced liver injury,suggested that autophagy might be protective effect in acute ethanol-induced liver dia.
【期刊名称】brisbane《中国应用生理学杂志》
【年(卷),期】2018(034)002
【总页数】5页(P102-105,后插2)
【关键词】酒精;自噬;氯喹;肝损伤;小鼠
【作 者】桑文华;曾美纯;陈莎;陈然;范小芳;龚永生;张海邻;张宏宇;孔晓霞
【作者单位】温州医科大学基础医学院低氧医学研究所,浙江温州325035;温州医科大学基础医学院低氧医学研究所,浙江温州325035;温州医科大学基础医学院低氧医学研究所,浙江温州325035;温州医科大学基础医学院低氧医学研究所,浙江温州325035;温州医科大学基础医学院低氧医学研究所,浙江温州325035;温州医科大学基础医学院低氧医学研究所,浙江温
money什么意思州325035;温州医科大学第二附属医院,浙江温州325035;温州医科大学药学院,浙江温州325035;温州医科大学基础医学院低氧医学研究所,浙江温州325035
【正文语种】中 文
【中图分类】R364.5
酗酒已成为肝脏疾病致死的主要原因之一［1］。一次饮酒过量或长期大量饮酒均可造成不同程度的肝损害，严重威胁人类健康［2］。饮酒相关的健康问题如酒精肝已成为我国的一大社会问题。酒精肝的致病因素单一，但其发生机制非常复杂，目前尚未完全清楚。有研究指出，炎症是酒精肝形成过程中的重要阶段，所以抑制炎症可能是治疗酒精肝的一种有效的策略［3］。
美容职业培训细胞自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖的降解产物再利用过程，是维持细胞能量平衡必不可少的途径［4］。迄今为止已证实，自噬与衰老、免疫、细胞死亡和分化有关，在退行性疾病和癌症等恶性疾病的发展中也有重要意义［5，6］。一般而言，在疾病发生发展过程中，一方面，自噬作为一种适应性机制，在疾病发展的早期清除了受损的细
胞器和蛋白，产生的营养物质和能量用于恢复组织的稳态；另一方面，过度激活的自噬过程导致的细胞死亡即自噬性细胞死亡，则加速疾病的发展和恶化［7-9］。细胞自噬的分子机制十分复杂。有研究表明，抑制自噬可增加体外培养大鼠肝细胞中的TG水平，增强自噬可减少肝脏脂肪的过度积聚［10］，但自噬在急性酒精中毒中的具体作用及机制尚不清楚。本研究通过使用氯喹抑制自噬，在动物模型中观察自噬在急性酒精中毒中的作用及对炎症的影响，为临床应用诱导自噬药治疗酒精中毒提供根据。
1 材料与方法
1.1 材料
抗 nuclear factorκB（NF-κB）p65、LC3、Lamin A和β-actin单克隆抗体购自Abcam公司。油红O及HE染色相关试剂购自Sigma公司；甘油三酯（TG）试剂盒、ALT、AST试剂盒购自北京普利莱基因有限公司；TNF-α、IL-6试剂盒购自北京华英生物技术研究。
1.2 动物模型构建
取20～25 g雄性C57BL／6小鼠，购自温州医科大学实验动物中心。21只小鼠适应性饲养
（普通饲料）1周后随机分为3组（n＝7）：对照组，酒精组，氯喹干预组。根据文献［11］，酒精组按 4.5 g／kg剂量给予33%（V／V）酒精灌胃一次，每两只给药间隔20 min。对照组给予等体积饮用水。氯喹干预组腹腔注射氯喹60mg／kg，30min后酒精灌胃，剂量同酒精组［12］。酒精处理后18 h实验结束，乙醚麻醉小鼠，眶后静脉丛取血分离血清，-80℃保存；剖腹取肝脏，称重后取部分置液氮中冻存，其余部分以4%多聚甲醛固定。
1.3 肝组织病理学检查和血清生化指标检测
肝组织石蜡切片，行常规HE染色。小鼠肝组织冰冻切片，行常规油红O染色。光镜下观察油红O及HE切片，评估肝脏脂肪变性情况。利用组织TG试剂盒，酶法测定肝组织TG含量。按照试剂盒说明书操作，采用全自动生化分析仪测定血清AST、ALT活性。
1.4 炎症因子检测
以酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清中炎症因子TNF-α、IL-6水平，实验按说明书完成。
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1.5 免疫荧光染色
肝组织石蜡切片经常规烤片，脱蜡。微波炉高火加热柠檬酸抗原修复液1 min，将组织切片浸入，再次高火加热1min，取出切片，PBS洗涤3次。5%BSA室温封闭20 min，加入特异性抗 LC3抗体（1∶100稀释），4°C孵育过夜。次日，PBST洗 3次，加入荧光素标记的相应二抗（1∶500稀释），室温孵育30 min，PBST洗 3次，加入 DAPI（1∶500稀释）孵育 10 min，封片，共聚焦显微镜拍照。实验重复3次。
1.6 Western blot检测
将肝组织剪碎置匀浆器中匀浆，裂解30 min后，将裂解液移至 1.5 ml离心管中，4℃、12 000 r／min离心 15 min。取上清置-20℃保存。应用 BIORAD法测定蛋白含量。取50μg组织蛋白做SDSPAGE电泳，将蛋白样本转移至PVDF膜上。取出膜后用5%脱脂奶粉封闭1 h，PBST洗3次，分别加入特异性抗 NF-κB p65、抗 TNF-α和抗 IL-6抗体，4°C孵育过夜。次日，PBST洗3次，加入髓过氧化物酶标记的相应二抗，置脱色摇床上摇1 h，PBST洗3次。Bio-Rad凝胶成像系统拍照分析，以β-actin为内参蛋白。实验重复3次。
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1.7 统计学处理
所有数据均用均数±标准差（）表示，采用SPSS 15.0软件处理。多组间的比较采用单因素方差分析，组间差异比较采用q检验。
2 结果
2.1 氯喹对急性酒精诱导的肝脏脂肪变性的影响
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HE染色结果显示：对照组肝组织形态结构正常，未见脂肪空泡；酒精组小鼠肝组织有明显的脂肪空泡产生，提示酒精引起脂肪堆积；与酒精组相比，氯喹作用后，肝组织充满大量大小不一的脂肪空泡（图1A）。油红O染色结果显示：对照组小鼠肝组织中未见明显的红色脂滴；酒精组小鼠可见中等量的红色脂滴，呈小颗粒状，进一步证实酒精引起脂肪变性；与酒精组相比，氯喹组小鼠肝组织可见大量红色脂滴，呈较大颗粒状（图1B，图1见彩图页Ⅱ）。
2.2 氯喹对肝组织TG含量及血清AST和ALT活性的影响
酒精组肝组织TG含量、血清AST与ALT活性均显著高于对照组（P＜0.05，P＜0.01），氯喹 +酒精组上述指标均分别明显高于酒精组（P＜0.05，表1）。
2.3 氯喹对肝组织中LC3蛋白表达的影响
自噬相关蛋白LC3是自噬过程中的关键蛋白之一，是自噬体形成双层膜结构的主要组成部分，已广泛用于衡量细胞自噬激活水平。肝组织LC3免疫荧光染色结果表明：对照组肝组织LC3蛋白荧光表达很弱，平均荧光强度为（58.63±4.58）%。与对照组相比，酒精组LC3蛋白的荧光表达显著增加，平均荧光强度为（134.15±6.76）%，提示酒精增加了肝细胞的自噬水平；而氯喹干预组LC3蛋白的荧光表达进一步增加，平均荧光强度为（241.94±8.17）%（图 2A）。Western blot蛋白检测结果表明：对照组 LC3-Ⅱ蛋白为 0.89±0.32，LC3-Ⅱ／LC3-I比值为1.02±0.14。与对照组比较，酒精组 LC3-Ⅱ蛋白表达增加至 1.63±0.17（P＜0.05），LC3-Ⅱ／LC3-I比值增加至 1.89±0.26（P＜0.05）；与酒精组相比，氯喹干预组 LC3-Ⅱ蛋白的表达增至 1.98±0.32（P＜0.05），LC3-Ⅱ／LC3-I比值增至 3.26±0.11（P＜0.05，图 2B、2C，图 2见彩图页Ⅱ），这表明自噬抑制剂氯喹明显增加酒精诱导的自噬标志性蛋白LC3Ⅱ的表达，提示细胞自噬体与溶酶体融合和降解过程被显著抑制。发证机构
Tab.1 The changes in TG amount of hepatic tissue and rum AST and ALT activities in e
contraband
ach group（，n＝7）TG：Triglyceride；AST：Serum aspartate aminotransfera；ALT：Alanine aminotransfera*P＜0.05；**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05 vs ethanol groupGroup TG（mg／g） AST（U／L） ALT（U／L）Control 34.5±4.1 82.4±18.2 67.3±15.7 Ethanol 68.2±3.9*200.3±16.8**145.6±8.1**CQ+Ethanol 87.5±2.6＃ 284.1±33.8＃ 201.8±17.3＃
2.4 氯喹对肝组织中炎性因子表达的影响
Western blot检测结果表明：与对照组NF-κB p65表达（1.08±0.21）%相比，酒精组 NF-κB p65的表达显著增加至（1.96%±0.23）%（P＜0.05）；氯喹干预组 NF-κB p65的表达进一步增加至（3.43% ±0.45）% （P＜0.05）。ELISA检测结果表明：与对照组小鼠血清 TNF-α水平（68.66±12.47）pg／ml相比，酒精组血清 TNF-α显著增加至（408.14±39.61）pg／ml（P＜0.01）；氯喹干预组血清 TNF-α进一步增加至（652.27±28.39）pg／ml（P＜0.05）。与正常组小鼠血清 IL-6水平（44.34±6.39）pg／ml相比，酒精组血清 IL-6水平显著增加至（171.68±22.34）pg／ml（P＜0.01）；与酒精组相比，氯喹干预组血清 IL-6水平显著增加至（251.32±10.83）pg／ml（P＜0.05，表2）。
