|------------------------------------------------------------------2021,Vol.38No.02化学金住的工轻
Chemistry&Bioengineering
doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2021.02.006
蔡世欣，李敏，侯余勇，等.芦苇秸秆混合发酵制备乙醇的工艺优化[J].化学与生物工程,2021,38(2)=26-31,35.
CAI S X,LI M,HOU Y Y,et al.Optimization in preparation process of ethanol from reed straw by mixed fermentation o£Saccharo-myces cerevisiae and Candida utilis[S}.Chemistry&Bioengineering,2021,38(2)：26-31,35.
芦苇秸秆混合发酵制备乙醇的工艺优化
蔡世欣1，李敏1，侯余勇2，王巍杰"，陈方见八
(1.华北理工大学生命科学学院，河北唐山063210；
2.中国科学院天津工业生物技术研究所天津市工业生物系统与过程工程重点实验室，天津300308)
privateequity
摘要：以芦苇秸秆为原料，用混合碱液对其进行预处理以促进秸秆纤维素糖化，再通过酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae^和产肮假丝酵母(Candida"方Zis)混合发酵制备乙醇，在单因素实验的基础上，采用Plackett-Burman(PB)实验、最陡爬坡实验和响应面实验对制备工艺进行优化。结果表明，芦苇秸秆混合发酵制备乙醇的最优工艺为：混合碱液(NaOH：尿素=3.85:1)预处理60目芦苇秸秆、酿酒酵母与产脱假丝酵母配比3:2、混合酵母接种量12%、发酵温度34°C、纤维素酶用量12%、转速140r•min-1，料液比1:35(g:mL)、发酵时间72h、pH值4.8，在此条件下，乙醇含量达到9.81g-f1o
关键词：酿酒酵母；产脱假丝酵母；乙醇；混合发酵；工艺优化
中图分类号:TQ920.6TQ353Q939.97文献标识码：A文章编号：1672-5425(2021)02-0026-06
Optimization in Preparation Process of Ethanol from Reed Straw by
Mixed Fermentation of Saccharomyces cerevisiae and Candida utilis
考研英语阅读理解CAI Shixin1,LI Min1,HOU Yuyong2,WANG Weijie1*,CHEN Fangjian2*
(1.College of Life Science,North China University of Science and Technology,Tangshan063210,China；
2.Tianjin Key laboratory for Industrial Biological Systems and Bioprocessing Engineering,Tianjin
Institute of Industrial Biotechnology, Chine Academy of Sciences,Tianjin3003089CAintz) Abstract:Using reed straw as a raw material,we firstly ud mixed alkali liquor to promote the saccharification of straw cellulo・Then,we prepared ethanol by mixed fermentation of Saccharomyces cerevisiae and Candida utilis.Moreover,we optimized the preparation process by Plackett-Burman(PB)experiments?the steepest climb experiments；and respon surface methodologies on the basis of single-factor experiments.The optimal preparation process of ethanol from reed straw by mixed fermentation of Saccharomyces cerevisiae and Candida utilis can be determined as follows：60mesh reed straw is pretreated by mixed alkali liquor(NaOH!urea=3・85 !1), the ratio of Saccharomyces cerevisiae and Candida utilis is3:2,and the parameters such as the mixed yeast inoculation amount of12%,the fermentation temperature of34°C9the cellula amount of12%,the rotating speed of140r•min-1, the solid-liquid ratio o£1!35(g!mL),the fermentation time of72h,and the pH value of4.8,are adopted.Under above conditions?the ethanol content reaches9.81g•L_1.
Keywords:Saccharomyces cerevisiae^Candida utilis；ethanol；mixed fermentation；process optimization
基金项目：河北省大学生创新创业训练计划项目(X2018056)，国家重点研发计划项目子课题(2019YF
A090460203)
收稿日期：2020-07-21
作者简介：蔡世欣(1996-)，男，江苏徐州人，硕士研究生，研究方向：生物发酵,E-mail：；通讯作者：王巍杰，教授，研究方向：生物质合理应用，E-mail：weijiewang@yahoo,com；陈方见，副研究员，研究方向：微生物养殖及高值产品开发，E-mail：chen_£@tib.cas o
随着工业的迅速发展，世界石油消耗量急剧增长，能源短缺问题日益突出，生物质能源作为可再生能源逐渐成为世界各国研究的热点然而，原料成本高成为制约生物质能源发展的主要瓶颈，低成本的植物纤维因可作为发酵底物而受到广泛关注阂。纤维素作为一种大分子多糖是目前分布最广的生物质，为生物质能源的生产提供了大量原材料冏。我国秸秆类生物质大多被直接燃烧，不但造成资源浪费，还污染环境。利用秸秆发酵生产燃料乙醇既能保护环境，也可充分利用资源，创造经济价值⑷。鉴于此，作者以芦苇秸秆为原料，用碱液对其进行预处理以
促进秸秆纤维素糖化，再通过酿酒酵母Q Saccharomyces cerevisiae）和产航假丝酵母（Candida utilis）混
合发酵制备乙醇，在单因素实验的基础上，采用Plack-ett-Burman（PB）实验、最陡爬坡实验和响应面实验对制备工艺进行优化。
1实验
1.1材料、试剂与仪器
芦苇秸秆，采自华北理工大学曹妃甸校区周边。
纤维素酶，和氏璧生物技术有限公司；酵母膏、胰
蛋白陈，英国Oxoid公司；所用试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
SLQ6A型粗纤维测定仪；THZ-92A型气浴恒温振荡器;T6型紫外可见分光光度计；HHS-21-6型数显恒温水浴锅。
1.2菌种与培养基
酿酒酵母，安琪酵母股份有限公司；产阮假丝酵母，鹤壁百惠生物科技有限公司。
基础培养基：1%酵母膏、2%蛋白陈、2%葡萄糖的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（9.2mL0.1mol•柠檬酸
溶液+10.8mL0.1mol•柠檬酸钠溶液,pH 值4.8）。
发酵培养基：2.0%蛋白腺、0.1%磷酸二氢钾、1.0%磷酸氢二钾、0.1%硫酸镁、0.1%氯化钠的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。
1.3预处理方式的选择
分别称取5.0g粉碎过20目、40目、60目和80
目筛的芦苇秸秆置于锥形瓶中，按料液比1:10（g: mL，下同）加入50mL碱液（NaOH或NaOH：尿素=3.85:1），置于80°C水浴锅中预处理2h；将预处理过的芦苇秸秆多次冲洗，烘干；采用粗纤维测定仪测定芦苇秸秆中纤维素含量，以确定最优的预处理方式。1.4发酵方式的选择
发酵菌种的选择：称取预处理后的芦苇秸秆5.0 g，按料液比1:30加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液和10%纤维素酶。将在基础培养基中生长至对数期的酿酒酵母、产航假丝酵母或混合酵母（1:1，酿酒酵母和产航假丝酵母的配比）按10%接种量分别接种至发酵培养基中；于30°C,150r-min-1发酵70h；然后采用DNS法皈测定发酵液中还原糖含量，采用重箔酸钾比色法⑷测定发酵液中乙醇含量，以确定最优发酵菌种。
混合酵母配比的选择：将不同配比（1:1、2:3、3：2、4：1、1：4）的混合酵母按上述方法分别接种
至发酵培养基中，测定发酵液中乙醇含量，以确定混合酵母的最优配比。
1.5芦苇秸秆混合发酵制备乙醇的工艺优化
1.5.1单因素实验
分别考察混合酵母接种量（6%、7%、8%、9%、10%、11%）、纤维素酶用量（6%、8%、10%、12%、14%）、料液比（1:20.1:25.1:30.1:35、1:40）、转速（120r•min-1,130r•min-1,140r•min_\150r •min-\160r•min-1）.发酵时间（24h、48h、60h、72h、84h）、发酵温度（28°C、30°C、32°C、34°C、36°C）对乙醇含量的影响。
1.5.2响应面实验
在单因素实验的基础上，选取混合酵母接种量、纤维素酶用量、料液比、转速、发酵时间、发酵温度等6个
因素的高、低水平（表1），利用Design-Expert&0.6 Trial软件设计Plackett-Burman（PB）实验，筛选出影
响最大的3个因素进行最陡爬坡实验；以最陡爬坡实验确定的中心点、采用Box-Behnken（BB）设计响应面实验，优化芦苇秸秆混合发酵制备乙醇的工艺条件。
表1PB实验的因素与水平
Tab.1Factors and levels of PB experiments
因素-
水平
-11 X2.混合酵母接种量/%911
X3.纤维素酶用量/%812
&.料液比/(g:mL)1:251:30
X6.转速/(r•min-1)120160
X8•发酵时间/h6084
X9•发酵温度厂C3034
2结果与讨论
2.1葡萄糖和乙醇的标准曲线（图1）
.2.9
.6.3
(1 • 8)、
啊如勰W 艇
.O O.0.00.30.60.98 6 4
2 0
(L •
8)、
*
如S 2
0.00.1
0.20.3
1.2
图1葡萄糖（时和乙醇（b ）的标准曲线
Fig. 1 Standard curves of gluco(a) and ethanol(b)
对图1曲线进行拟合，得葡萄糖和乙醇的线性回 归方程分别为:y=l. 017^-0. 0294（^2 =o. 9948）,y
= 20.047^-0. 1046（衣=0. 9988）。表明，葡萄糖含
量在0〜1. 2 g • LT 范围内、乙醇含量在0〜7 g • L -1
范围内与吸光度线性关系良好。
2.2预处理方式对纤维素含量的影响（图2）
从图2可以看出，对于不同目数的芦苇秸秆，采用 添加尿素的混合碱液（NaOH ：尿素=3. 85 : 1）预处
理后的纤维素含量均明显高于采用单一碱液（NaOH ） 的；其中60目芦苇秸秆用混合碱液（NaOH ：尿素=
3.85 : 1）预处理后，纤维素含量达到60.7%。因此, 确定采用混合碱液（NaOH ：尿素=3. 85 ： 1）对60目
80—■—NaOH ：尿素=3.85：1 -NaOH
o
o o o O
7 6 5 4 320 40
60 80
目数reason是什么意思
图2预处理方式对纤维素含量的影响
Fig. 2 Effect of pretreatment mode on cellulo content
芦苇秸秆进行预处理。
2.3单一酵母发酵和混合酵母发酵效果对比（图3）
图3单一酵母发酵和混合酵母发酵效果对比
Fig. 3 Comparison of fermentation effect of single yeast and mixed yeasts
从图3可以看出，混合酵母（1 : 1）发酵时的乙醇含
量明显高于单一酵母发酵，比酿酒酵母和产阮假丝酵母 发酵时的乙醇含量分别提高了28.76%和42. 78%。表
明，芦苇秸秆混合酵母发酵可以有效提高乙醇含量。 因此，确定采用芦苇秸秆混合酵母发酵制备乙醇。
2.4混合酵母配比对乙醇含量的影响
当酿酒酵母与产航假丝酵母配比分别为1 : 1、
2 ： 3、
3 ： 2、
4 ： 1、1 ： 4时，发酵液中乙醇含量分别为
7. 24 g • L"1、& 17 g - LT 、9. 05 g • L"1、8. 92 g -
L-\6. 17 g • L-\其中，在酿酒酵母与产阮假丝酵
母配比为3 : 2时，乙醇含量最高。因此，确定混合酵
母最优配比为3 ： 2。
2.5最优制备工艺
2.5.1单因素实验结果（图4）
从图4a 可以看出，随着混合酵母接种量的增加,
乙醇含量先快速升高后趋于稳定；在混合酵母接种量
为10%时，乙醇含量达到最高。因此，混合酵母接种
量以10%较为适宜
。
範7.6如桃72
7 7,28.4
•Tg.o
—1
6810 12 14
6.8
Bi 各 4 Results of single-factor experiments
料液比/（g ：mL ）
从图4b 可以看出，随着纤维素酶用量的增加，乙 醇含量快速升高；当纤维素酶用量超过10%后，乙醇
含量升速趋缓。综合考虑成本等因素，纤维素酶用量 以12%较为适宜。
从图4c 可以看出，随着料液比的减小，即柠檬酸-
柠檬酸钠缓冲溶液用量的增加，乙醇含量呈先升高后
降低的趋势。可能是因为，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液 用量较少时，发酵液中酵母菌的密度较大，抑制了酵母
菌的生长，乙醇含量较低；当含水量超过35%（料液比 为1 : 35）时，由于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液用量过
多造成发酵液中酵母菌浓度降低，且发酵液体积大容 易染菌、酵母菌与还原糖接触的概率降低等原因导致
乙醇含量下降。因此，料液比以1 ： 35较为适宜。
从图4d 可以看出，随着转速的增大，乙醇含量呈
先升高后降低的趋势；在转速为140 r • min-】时，乙醇 含量达到最高，为& 32 g • L-^这是因为，在一定范
围内转速的增大为发酵提供了更多的溶氧，为纤维素 酶和芦苇秸秆的充分接触提供了有利条件，也为培养 基提供了更多的溶氧，促进了酵母菌的生长，进而积累
a number of
了更多的乙醇。因此，转速以140 r • min-1较为适宜。
从图4e 可以看出，随着发酵时间的延长，乙醇含
量不断升高；当发酵时间超过72 h 后，乙醇含量趋于
稳定，可能是因为还原糖被完全消耗。因此，发酵时间 以72 h 较为适宜。
从图4f 可以看出，随着发酵温度的升高，乙醇含
量呈先升高后降低的趋势；在发酵温度为32 °C 时，乙 醇含量达到最高，为& 02 g • L-10这是因为，发酵温
度较低时，酵母菌活性低，且纤维素酶糖化速率慢，导致 糖供给不足影响了乙醇含量；虽然在较高的发酵温度
下，纤维素酶能更有效地促进芦苇秸秆纤维素糖化，但 会影响酵母菌活性。因此，发酵温度以32 °C 较为适宜。
2. 5. 2 PB 实验结果
PB 实验设计与结果见表2，结果分析见表3。
表2
PB 实验设计与结果
Tab. 2
Design and results of PB experiments
序号
因素
乙醇含量
Xi x 2
X 3X4X 5X 6x 7
help meX 8
x 9
X10X11g • L_11
11-1
111-1-1-11
-1
7.692-1
11-1
111-1-1-11
7.653
1-1
11-1
111-1-1-1
7.74
4-1
1-1
11-1
111-1-18.725
-1-11-1
11-1
111-1
7.966-1-1-11-1
1
1-1
1
117.48havesupper
7
1-1-1-11-111-1117.74811-1-1-1
1
-1
11-1
1&0591
11-1-1-11-1
11-1
7.8410-1111-1-1-11-1
11& 13
11
1
-1
1
1
1-1-1-11-1
1
7. 1712-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1
7.
15
表3PB实验结果分析challenge用法
Tab.3Analysis of results of PB experiments
因素效应平方和影响/% X2•混合酵母接种量0.4738330.67355433.46
X3.纤维素酶用量-0.05916670.01050210.52 X.料液比0.09083330.0247521 1.23
X6.转速-0.02583330.002002080.10
X8.发酵时间0.5611670.94472446.92
X9.发酵温度0.1888330.106974 5.31
nippon paint从表2、表3可以看出，6个因素对乙醇含量影响的大小顺序为：发酵时间〉混合酵母接种量〉发酵温度〉料液比>纤维素酶用量〉转速；其中发酵时间、混合酵母接种量和发酵温度对乙醇含量的影响较大，且这3个因素对乙醇含量的影响均呈正效应，效应大小顺序为：发酵时间〉混合酵母接种量〉发酵温度。
2.5.3最陡爬坡实验结果
采用最陡爬坡实验快速获得最大乙醇含量区域，有效建立响应面拟合方程。最陡爬坡实验设计与结果见表4。
表4 Tab.4
最陡爬坡实验设计与结果
Design and results of the steepest ascent experiments
序号混合酵母接种量发酵时间发酵温度乙醇含量%h°C g•L i
11070329.18
21171339.38
31272349.65
41373359.21
51474369.10
从表4可以看出，当混合酵母接种量为12%、发
酵时间为72h、发酵温度为34°C时，乙醇含量达到最高，为9.65g•L"1o
2.5.4响应面实验结果
在PB实验的基础上，以最陡爬坡实验确定的混合酵母接种量12%、发酵时间72h、发酵温度34°C作为中心点，采用Box-Behnken设计响应面实验，因素与水平见表5，结果见6，方差分析见表7。
用Design-Expert软件对响应面实验结果进行二
次多项回归拟合，得回归方程为：丫=一2345.18306+ 37.28339A+57.22313B+4.95892C+0.10856AB-0.12215AC+0.027879BC-1.84015A2-0.41166B2 -0.082820&。
从表7可以看出，模型F值为22.64,P值为0.0002，表5
Tab.5Factor
响应面实验的因素与水平
s and levels of respon surface methodologies 因素
水平
学汽车美容
-101
A.混合酵母接种量/%101214
B.发酵时间/h707274
C.发酵温度/°C303438
表6响应面实验结果
Tab.6Results of respon surface methodologies 序号A B C Y.乙醇含量/(g・LT 1--1-10 6.02
21-10 6.51
3--110 5.45
4110 6.82
5--10-1 5.28
610-17.18
7--101 6.84
8101 6.78
90-1-1 6.89
1001-17.26
110-11 5.72
12011 6.98
130009.79
140009.79
150009.79
160009.52
170009.52
表7方差分析
Tab.7Variance analysis
方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型40.179 4.4622.640.0002**
A 1.721 1.72&720.0213*
B0.2310.23 1.190.3113
C0.01110.0110.0550.8207
AB0.1910.190.960.3607gee什么意思
AC0.9510.95 4.840.0637
BC0.210.2 1.010.3486
A214.26114.2672.310.0001
** B211.42111.4257.90.0001**
C27.3917.3937.50.0005**
残差 1.3870.2
失拟项 1.2930.4320.070.0071
净误项0.08640.021
总离差41.5516
复相关系数0.9968变异系数 5.98
校正决定系数0.9941精密度46.981
预测复相关系数0.9906
注:*表示差异显著,P<0.05；**表示差异极显著,P<0.01o
