中国农业科技导报,2008,10(6):110-117Journal of Agricultural Science and Technol ogy
收稿日期:2008210207；修回日期:2008211218
基金项目：国家“十一五”科技支撑计划项目(2006BAD05A01)资助。 作者简介：韩飞，副研究员，博士，主要从事粮油(食品)营养与功能研究。E 2mail:hf@chinagrain
大豆降压肽的生产工艺研究
韩 飞1
, 于婷婷1
, 周孟良
2
(1.国家粮食局科学研究院，北京100037;2.扬州大学，江苏扬州225009)
摘 要：应用4种蛋白酶酶解大豆分离蛋白，研究其水解效果和降压活性。实验选定碱性蛋白酶为生产大豆降压肽的最适酶，并对其酶解条件进行了优化，确定生产大豆降压肽的最佳条件为：温度60℃,pH 8.0，
底物浓度4%，碱性蛋白酶浓度4%，水解度14.4%，优化后的ACE 抑制率可达到84.1%。关键词：大豆蛋白;ACE 抑制肽；高效液相色谱；酶解；水解度
中图分类号:T Q464.7 文献标识码:A 文章编号:100820864(2008)0620110208
Stud i es on Produc i n g Technology of An ti hyperten si ve Pepti de D er i ved from Soybean Prote i n
HAN Fei 1
,Y U Ting 2ting 1
,Z HOU Meng 2liang
2,语感启蒙
(1.Acade my of State Grain Adm inistrati on,Beijing 100037; 2.Yangzhou University,J iangsu Yangzhou 225009,China )
Abstract:Four types of enzy mes were ud t o hydr olyze p repared s oybean p r otein is olates and
t o study degree of hydr olysis and ACE (angi otensin I 2converting enzy me )inhibit ory activity of the p r oduct .The results showed that alcala was the op ti m u m enzy me t o p r oduce s oybean pep tide .The op ti m u m alcala hydr olysis p r ocess for p r oducing ACE inhibit ory pep tides was under 60℃,with pH 8.0,4%substrate concentrati on,4%enzy me concentrati on,and 14.4%hydr olysis degree .After op ti m izati on,the ACE inhibit ory activity can reach 84.1%.Key words:s oybean p r otein;angi otensin I converting enzy me inhibit ory pep tide;high perf or mance liquid chr oma 2
t ograpy (HP LC );enzy matic hydr olysis;degree of hydr olysis
大豆被列为水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物，在我国粮食安全中起着举足轻重的作用。大豆作为来源最丰富且价廉的优质植物蛋白质原料受到了世界各国越来越广泛的关注。我国种植的大豆都是非转基因大豆，非常适合作为食品加工原料或食品添加基料，因此如何增加我国大豆的消费量及附加值是亟待解决的重大问题。
大豆蛋白是目前开发利用的植物蛋白中最优质的植物蛋白之一。由大豆蛋白酶解制得的大豆肽在食品加工和营养保健方面显示出其他植物蛋白无法比拟的优势，世界各国都高度重视高附加值大豆肽的制备和功能方面的研究。目前，研究具有降血压、抗氧化、促进矿物质吸收等特效功能肽的生物制备技术，已成为动、植物蛋白加工利用的热点和国家推进现代食品生物工程技术的重点内容之一。作为一种具有降血压功能的产品，要
求其蛋白质可控降解、功效明确、结构清晰、质量稳定，现在大豆肽的制备仍然存在较多的共性关键技术问题和机制性问题需要进行探讨和研究。本文研究了大豆降压肽制备的工艺问题，以期能
针对性的解决一些问题[1,2]
。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
大豆：黑龙江省的有机大豆；大豆分离蛋白：实验室自制;ACE 和马尿酰-组胺酰-亮氨酸(HHL ):Sig ma 公司产品;alcala (碱性蛋白酶)、neutra (中性蛋白酶)、flavourzy me (风味蛋白酶)、p r ota mex (复合蛋白酶):Novo 公司产品。1.2 主要仪器与设备
HJ 25多功能搅拌器：常州国华电器有限公
司;PHSJ23F型精密pH计：上海精科仪器有限公司;AB3042S电子天平:Mettler Toledo公司;T DL2 52A离心机:Anke公司；超高速冷冻离心机：日立公司;Free Z one2.5冷冻干燥机:Labconco公司；玻璃夹套酶反应器：玻璃厂定制；超级恒温水浴锅：常州国华电器有限公司;35型紫外可见分光光度计:Perkin building缩写
El m er公司;Agilent1100高效液相色谱仪(配有可变波长紫外监测器)：美国Agilent 公司；恒温鼓风干燥机:H921型常州国华有限公司。
1.3 试验方法埃及王子的主题曲
1.3.1 酶法生产大豆ACE抑制肽的工艺流程 大豆去皮后，粉碎过80目筛，正己烷脱脂处理后，碱提蛋白，酶解大豆分离蛋白，酶灭活后，离心取上清水解液，喷雾干燥，即得水解大豆蛋白ACE 抑制肽。
1.3.2 大豆分离蛋白的制备及提取条件优化 大豆脱皮后粉碎，过40目筛，筛下物用脂肪检测仪脱脂，取60g大豆粉用三倍体积正己烷脱脂，条件设定为浸提10m in，淋洗40m in，溶剂回收20m in，排干5m in，残渣即为脱脂大豆粉,4℃保存备用。
考虑到pH、料液比、温度、提取时间可能对提取效果产生较大的影响，对pH、固液比及浸提温度进行L9(3,3)正交试验。以蛋白提取率为指标选择最优条件。
1.3.3 水解酶的选择 分别选用4种蛋白酶水解大豆分离蛋白，反应在夹层玻璃反应器中进行。底物浓度为4%，水解条件分别为:
①碱性蛋白酶:[E]/[S]=4.0%,pH
8.0,60℃;
②风味蛋白酶:[E]/[S]=4.0%,pH
6.0,50℃;
③中性蛋白酶:[E]/[S]=4.0%,pH
7.0,50℃;
④复合蛋白酶:[E]/[S]=4.0%,pH
6.0,40℃。
分别在各种酶水解进行至5m in、10m in、20 m in、30m in、40m in、60m in、80m in、120m in、180 m in和240m in时读取流加碱液量计算水解度，并取样，所得样品立即置于沸水浴中加热15m in灭酶活，流水冷却，水解物在4℃,4000r pm离心20 m in，收集上清液用于ACE抑制活性的测定。1.3.3 碱性蛋白酶的水解条件优化 分别考察样品前处理、水解pH、温度、底物浓度、酶浓度对水解的影响，并进行条件的优化，以水解度为指标选择最优条件[3,4]。
webtrends
1.3.4 碱性蛋白酶水解制备ACE抑制肽 选用碱性蛋白酶作为制备大豆蛋白ACE抑制肽的合适用酶，考察在最适酶解条件下水解不同时间的产物的ACE抑制活性。
1.3.5 水解度(DH)的测定pH2stat法[5] 大豆蛋白水解度以水解断裂的肽键数目(h)占总肽键数目(h
tot
)的百分数来确定，即DH=h/h
tot ×100%。
在pH7.0以上进行蛋白质酶解时，释放的氨基酸会使溶液pH明显下降，通过流加碱液使体系保持固定的pH，根据消耗的碱量可计算水解度。计算公式如下:
DH=
h
h tot
×100%
=V NaOH・
1
α
・
C N aOH
Mp
・
1
h tot
(公式1)
式中:V
Na OH
为水解过程中所消耗的Na OH量;C
Na OH
为
Na OH溶液的摩尔浓度;α为α-氨基酸解离度,α= 10(pH-pK)/[1+10(pH-pK)],pK为大豆蛋白质α-氨基的pK,pH为实验中采用的pH;Mp为底物蛋白质的总量;
h tot为每g蛋白质中肽键的摩尔数，取值为8.38。
1.3.6 ACE抑制活性的测定[6,7] 三肽马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)在ACE的催化下可快速分解产生马尿酸和二肽H is2Leu(简称HL)，当加入ACE抑制肽样品时,ACE的活性受到抑制，马尿酸和二肽的生成量减少，因此通过HP LC测定马尿酸的生成量可评价ACE抑制肽对ACE活性的抑制率。计算公式为:
R=
B-A
A
・100%(公式2)式中:R为ACE抑制肽样品对ACE的抑制率(%);A 为空白对照组中马尿酸的峰面积(mAU・s);B为添加水解液组中马尿酸的峰面积(mAU・s)。
ACE溶液的配制：将1U的ACE溶于10mL 0.1mol/L的硼酸缓冲液(pH8.3，含0.3mol/L NaCl)中即得，分装后在-20℃低温保存。
HHL溶液的配制：取HHL适量，以0.1mol/ L的硼酸缓冲液(pH8.3，含0.3mol/L NaCl)溶解配成6.5mmol/L HHL溶液，分装后在-20℃低
111
6期韩 飞等：大豆降压肽的生产工艺研究
温保存。
马尿酸标准品的制备：取马尿酸标准品适量，用双蒸水配制成1mmol/L的马尿酸。
测定方法：灭酶活后的水解液于4000r pm 离心15m in，取上清液进行ACE抑制活性测定。取10μL样
品和50μL HHL溶液，于37℃保温6 m in，加入20μL ACE,37℃下反应30m in后，加入85μL1mol/L的HCl溶液终止反应，室温下过0. 22μm滤膜，取5μL反应产物进样，通过HP LC 洗脱图谱定量马尿酸生成量，以马尿酸的生成量来判断样品对ACE活性的抑制作用，同时做空白对照。
色谱条件:Agilent1100，采用HP LC系统: Z ORBAX S B2C18色谱柱:(4.6mm×150mm,5μm)，流速1.0mL/m in，检测波长228n m，进样量5μL，柱温30℃，流动相12%乙腈(含0.5%乙酸)。
2 结果与分析
2.1 去皮大豆粉主要成分分析
1所示。
2.2 大豆分离蛋白提取的正交分析
对影响大豆蛋白质提取率的pH、固液比及浸提温度进行L9(33)正交试验，试验的条件和结果如表2所示。
经分析，大豆分离蛋白提取的最佳水平为A2B2C2，工艺流程为pH9.0，料液比为1∶10，提取温度40℃。
2.3 不同蛋白酶对大豆蛋白的水解
酶法水解蛋白质是目前获得ACE抑制肽的主要途径，该方法的优点是生产成本低，而且产品的安全性高，无副作用。一旦确定蛋白源后，酶的选择便成为生产ACE抑制肽的关键。现有的研究表明ACE抑制肽并没有固定的结构，因此很难根据酶的特异作用方式从理论上去推断适合生产大豆蛋白ACE抑制肽的合适用酶。因此要高效制备大豆蛋白ACE抑制肽首先面临的问题就是酶的筛选。
本研究选取了4种常见的商业化蛋白酶处理大豆蛋白，分别在各种蛋白酶的理论最适条件下对大豆蛋白进行水解，水解进程曲线如图1所示。
由图1可见，几种蛋白酶对大豆分离蛋白的水解呈现较为一致的趋势，但速率有所不同。在水解反应的最初阶段(1h内)，蛋白质分子中可断裂的肽键很多，比较敏感的肽键快速断裂开,
表1 去皮大豆粉主要成分
Table1 The main compositi ons of the blanched s oybean.
成分I ngredient蛋白质Pr otien脂肪Fat水分Moisture
水溶性蛋白
W ater2s oluble p r oteins
化学方法(%)
Chem ical method(%)
36.6017.7910.6231.46
DA7200测定(%)
DA7200deter m inati on(%)
39.5118.3611.1732.28
表2 大豆分离蛋白的制备正交实验方案及结果
Table2 Design and result of the orthogonal experi m ent of s oybean p r otein is olates p reparati on.
实验号Experi m ent nu mber pH
料液比
Solid2liquid rati o
提取温度(℃)
Extracti on te mperature(%)
蛋白提取率(%)
Pr otein extracting rati o(%)
1A1(8.0)B1(1∶8)C1(30)77.62
2A1B2(1∶10)C2(40)79.20
3A1B3(1∶12)C3(50)79.35
4A2(9.0)B1C378.44
5A2B2C179.16
6A2B3C278.87
7A3(10.0)B1C277.54
8A3B2C378.77
9A3B3C178.68
211中国农业科技导报10卷
图1 不同蛋白酶酶解大豆分离蛋白的酶解进程曲线
F i g.1 Hydr olysis curves of s oybean p r otein with
vari ous p r oteas.firs
水解速度非常快；但随着水解的进行,2～4h期间可供蛋白酶水解的肽键数目不断减少，水解的速度不断减慢，一段时间过后，体系中的酶活力下降或者丧失，或由于多个底物与酶结合会导致产物的竞争性抑制作用[8]，到4h后，水解度基本不再升高。此外，不同蛋白酶水解大豆分离蛋白的速度存在差异，这与蛋白酶的底物特异性有关。碱性蛋白酶对羧基端有疏水性氨基酸的肽键有特异性作用，水解4h后水解度可达到21.6%；复合蛋白酶是一种杆菌蛋白酶复合体，对底物的特异性要求相对较宽,4h后的水解度可达17.6%；中性蛋白酶主要作用于芳香族氨基酸的羧基参与形成的肽键，它对大豆分离蛋
白的水解作用低于碱性蛋白酶和复合蛋白酶；风味蛋白酶虽然作用范围广，但对大豆分离蛋白的水解作用相对较弱，水解4h后水解度达到12.5%，因此从原料利用率的角度考虑，碱性蛋白酶较适合于大豆蛋白多肽的生产用酶。
2.4 不同蛋白酶水解产物的ACE抑制活性的
bitch啥意思测定
本实验选用4种常见的商业用酶分别对大豆分离蛋白进行酶解处理，并测定了各自不同酶解时间所得水解液的ACE抑制活性，实验结果见表3。
表3 不同蛋白酶水解大豆分离蛋白所得水解产物的ACE抑制率(%) Table3 ACE inhibit ory activities of hydr olysates with different p r oteas(%).
蛋白酶Pr oteas
时间(m in) Ti m e(m in)
05102030406080120180240
碱性蛋白酶
厌倦是什么意思
A lcala
-83.282.384.183.883.183.383.581.679.882.1中性蛋白酶
Neutra
-33.336.536.239.638.138.236.836.937.436.0复合蛋白酶
Pr ota mex
-52.351.252.755.652.850.752.250.246.947.9风味蛋白酶
Flavourzy me
-53.953.354.453.554.554.358.854.557.455.7
由表3可见，未经蛋白酶处理的大豆分离蛋白几乎没有ACE抑制活性，但酶解产物却表现出抑制作用(>30%)，由此可说明ACE抑制活性是由酶解后所产生的肽类物质所引起的。另一方面，大豆蛋白经酶解后的水解物对ACE的抑制活性并非简单的或有或无，而是都存在，只是在活性的强弱上存在区别，这可能是由酶解物组成的复杂性和ACE较宽的底物特异性所决定的。
对比相同时间点水解度与ACE抑制率，中性蛋白酶水解物的最高ACE抑制率为39.6%，对应水解度为11.5%；复合蛋白酶的最高ACE抑制率为5516%，对应水解度为13.6%；风味蛋白酶的最高ACE抑制率为58.8%，对应水解度为1113%；碱性蛋白酶的最高ACE抑制率为8411%，对应水解度为14.4%。由实验结果可见，蛋白肽水解度与ACE抑制率并没有显示出相关趋势，即高水解度时并不意味着ACE抑制活性一定高[9]，且4种酶水解后的ACE抑制活性大小
311
6期韩 飞等：大豆降压肽的生产工艺研究
依次为碱性蛋白酶>风味蛋白酶>复合蛋白酶>中性蛋白酶。因此可以初步选定碱性蛋白酶作为生产大豆蛋白ACE 抑制肽的合适用酶。2.5 碱性蛋白酶水解大豆蛋白的条件优化
目前，监控蛋白质酶解反应进程最常用的指标是水解度，即酶解过程中被打断的肽键占总蛋白肽键的百分数。对任何一个特定的酶解反应，水解度的不同直接反映了酶解效果。由上面的实验可以知道ACE 抑制效果与水解度没有必然联系[9]
，但水解度的大小却决定了对水解物ACE 抑制活性的筛选范围。在酶解的最适温度和pH 下，影响水解度的因素包括反应前的预处理、底物浓度、酶浓度和反应时间，为了尽可能的提高水解效率，本实验以DH 为指标对碱性蛋白酶进行优化。2.5.1 前处理对水解的影响 由于大豆蛋白高度结构化，多肽链紧密折叠在一起，其二级结构中有α-螺旋、反平行结构和β-转角等，疏水性氨基酸在其内部形成疏水区域，外面被亲水外壳包裹，形成坚实的球形结构，这种牢固的结构难以被蛋白酶水解，对大豆蛋白进行适当的加热变性处理，可使大豆蛋白部分变性，各亚基间分开，那些原来包藏在分子内部，不易与酶作用的部位由于分子结构的松散而暴露出来，从而增加酶的作用
位点[10]
。而且在高浓度时直观表现为大豆蛋白达到均一的悬浮状态。不同处理温度对大豆蛋白水解度的影响见图2
gaychina。
图2 不同加热温度对大豆蛋白水解度的影响
F i g .2 Effects of hydr olyte on different te mperature
of the s oybean p r otein .
由图2可以看出预处理温度分别为60℃、70℃时，大豆分离蛋白4h 的水解度只略有增加,
而以70℃、80℃处理时水解度增加明显,90℃、
100℃时上升到最高，这可能是由于温度升高到80℃以上时，原来被掩埋的-SH 基团暴露出来,
使球蛋白分子展开，有利于水解反应的进行。有资料显示90℃预处理对水解产物的风味有所改善，其原因可能是高温使大豆分离蛋白中的脂肪氧化酶钝化，从而减少了苦味、腥味物质的产生。所以本文选择90℃为预处理最适温度，处理过程需不断搅拌。
2.5.2 pH 对水解效果的影响 pH 是酶反应的主要条件之一，最适pH 是酶促反应的重要参数。过酸过碱都会使酶的空间构象发生改变，使酶活降低，而且pH 可改变底物空间解离状态，影响与酶的结合。试验考察了pH 为6、6.5、7、7.5、8和8.5条件下进行水解4h 的水解度情况，结果见图3
。
图3 不同pH 对大豆蛋白水解度的影响
F i g .3 Effects of pH on hydr olyte of the s oybean p r otein .
由图3可见，随着pH 的增加水解度也逐渐升高，当pH 达到8.0时水解效果最好，继续加大pH，水解度反而下降，说明pH8.0为碱性蛋白酶的最适pH 。2.5.3 温度对水解效果的影响 温度对酶促反
应速度的影响主要从两方面考虑[10]
。一方面是当温度升高时，反应速度加快，这与一般的化学反应相同。另一方面，随温度升高而使酶逐步变性，其催化的反应速度下降。酶反应的最适温度就是这两种过程平衡的结果，在低于最适温度时，前一种效应为主，在高于最适温度时，则后一种效应为主。本实验比较了温度为50℃、55℃、60℃、65℃条件下水解4h 的水解度情况，结果见图4。
从图4中可以看出,60℃时蛋白提取率达到最高，说明当温度在60℃时化学反应速度与酶的失活速度之间形成一个较有利于蛋白提取的动态平衡，所以酶解温度定为60℃。
411中国农业科技导报10卷
图4 不同温度对大豆蛋白水解度的影响
F i g .4 Effects of te mperature on hydr olyte of the
s oybean p r otein .
2.5.4 底物浓度对水解效果的影响 底物浓度
即大豆蛋白含量与水的体积比，本实验以DH 为指标研究底物浓度对碱性蛋白酶水解作用的影响，如图5所示
。
图5 底物浓度对碱性蛋白酶水解作用的影响
F i g .5 The effect of substrate concentrati on on alcala
p r otea hydr olysis .
由图5可以清晰的看到，随着底物浓度的增加水解度逐渐降低，由此判断底物浓度的增加对酶有抑制作用，即多个底物分子可能竞争占据酶的活性位点，使酶不能发挥很好的效果。但是考虑到生产成本以及前期处理和后期分离浓缩的困难，应尽量提高底物浓度。综合考虑下，确定4%底物浓度下进行水解较适宜。
2.5.5 酶与底物比对水解效果的影响 酶的浓
度对水解效果起着至关重要的作用，它的添加量直接影响水解的效果。本次试验将底物浓度控制在4%，观察酶浓度变化对酶解反应进程的影响，结果如图6
。
图6 酶浓度对碱性蛋白酶水解作用的影响
F i g .6 The effect of p r otea concentrati on on
alcala p r otea hydr olysis .
由图6可知，底物浓度一定时(4%,w /v )，酶
用量增大，水解反应速度加快，但这种速度的变化并不是随着酶用量的加大而成比例增加。当酶用量达到某个值时，进一步增加酶用量，酶反应速度的增加变得越来越慢，同时酶用量的增大势必导致生产成本的提高，综合酶解速率和生产成本两方面的因素，碱性蛋白酶的用量可以选为4%。
比较了最适pH 、温度，以及在不同底物浓度和酶浓度用量条件下对大豆分离蛋白的水解作用，结果表明碱性蛋白酶在底物浓度4%，酶浓度4%,pH 8.0,60℃的条件下能达到令人满意的水解效率。
vat是什么意思2.6 利用碱性蛋白酶制备大豆分离蛋白ACE
抑制肽
实验考察了不同大豆蛋白水解物的ACE 抑制活性，结果见图7所示。
碱性蛋白酶是食品工业中常见的蛋白酶，它不仅可用于生产各种具有良好功能性质的食品蛋白水解物，还是生产食品蛋白ACE 抑制肽的良好酶源。国内外许多研究者用酶法水解其他蛋白
质，如向日葵蛋白[11]、牛皮明胶蛋白[12]
、面筋蛋白[13]
时均发现酶解产物的ACE 抑制活性随着水解度的变化而变化，而且活性与水解度之间并未
语文高考答案表现出可以预知的对应关系[9]
，本研究的结论也证实了这一点。
由图7可知，底物中加入碱性蛋白酶后,ACE 抑制活性迅速上升，大豆蛋白的碱性蛋白酶酶解产物在DH 为14.4%，对应水解时间为20m in 时,ACE 抑制活性达到最大值84.1%(见图8)。
5
116期韩 飞等：大豆降压肽的生产工艺研究
