作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(12): 2062−2072www.chinacrops/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@chinajournal
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.02062
大豆异黄酮组分HPLC快速分析技术及其在豆腐加工中的应用
王春娥1,2赵团结1盖钧镒1,*
1南京农业大学大豆研究所 / 国家大豆改良中心 / 作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095; 2九江学院生命科学学
院, 江西九江 332000
摘要: 大豆异黄酮育种与大豆制品加工研究需要进行大批量样品12种异黄酮组分的快速定量分析。在前人研究基
础上利用Agilent 1100高效液相色谱(HPLC)系统, 以大豆品种南农95C-13为材料, 研究大豆苷元、大豆苷、乙酰基
大豆苷、丙二酰基大豆苷、染料木苷元、染料木苷、乙酰基染料木苷、丙二酰基染料木苷、黄豆苷元、黄豆苷、乙
酰基黄豆苷、丙二酰基黄豆苷等12种标准品外标法快速定量技术。从样品制备与色谱条件对分析12种异黄酮组分
的准确度和分离度入手, 确定分析流程, 以(科丰1号×南农1138-2)的184个重组自交系(NJRIKY)为材料, 研究豆腐
加工中总量和各组分的变化特点。(1)样品以80%甲醇水溶液50℃超声1 h提取; 色谱条件为, 检测波长254 nm, 柱
温36℃, 流速 2.0 mL min–1, 进样量 10 μL, 流动相0.1%(V/V)乙酸水溶液(A)和100%甲醇(B), 0~2 min, 27% B
(V/V)→2~3 min, 27%~38% B→3~10 min, 38% B→10~12 min, 38%~39% B→12~14 min, 39% B→14~15 min, 39~27% B
梯度洗脱; 在15 min内将12个组分良好分离, 各组分峰面积与其相应浓度均呈良好线性关系(R2为0.9976~0.9999);
加标回收率均大于99%, 变异系数低于2%。(2)NJRIKY群体籽粒、豆乳、豆腐异黄酮总量和组分的大量分析验证了HPLC快速技术的效果。籽粒异黄酮总含量(3 695.00 μg g–1)在豆乳加工中平均85.15%转入豆乳(3 146.12 μg g–1), 14.85% (548.88 μg g–1)进入豆渣。传统豆腐加工通过硫酸钙絮凝, 只有17.32% (639.89 μg g–1)转入豆腐, 67.83% (2 506.23 μg g–1)留在黄浆水中。豆乳中12种组分含量比籽粒中稍低, 均以丙酰基染料木苷含量最高; 而豆腐中乙酰
基染料木苷和乙酰基黄豆苷缺失, 以染料木苷元与大豆苷元含量较高。大豆科丰1号与南农1138-2杂交重组后家系
间的异黄酮遗传变异增大, 增加了对其遗传改良的潜力。
关键词：大豆; 异黄酮组分; 高效液相色谱(HPLC); 梯度洗脱; 豆乳; 豆腐
Establishment of A Rapid HPLC Method for Quantifying Isoflavone Components and Its Application in Tofu Processing
WANG Chun-E, ZHAO Tuan-Jie, and GAI Jun-Yi*
1 Soybean Rearch Institute, Nanjing Agricultural University / National Center for Soybean Improvement / National Key Laboratory for Crop Genet-ics and Germplasm Enhancement, Nanjing 2
10095, China;
2 College of Life Science, Jiujiang University, Jiujiang 332000, China
Abstract: A rapid, preci, and stable quantifying method of isoflavone components is the key to quality soy–food processing and genetic improvement of quality soybeans. A quick procedure ud Agilent 1100 high performance liquid chromatograph (HPLC) system with the diode array detection (DAD) and Zorbax SB-C18 packed column (5 μm, 4.6 ID × 150 mm) using external stan-dards of isoflavone components, including daidzein, daidzin, 6”-O-acetyldaidzin, 6”-O-malonyldaidzin, genistein, genistin,
6”-O-acetylgenistin, 6”-O-malonylgenistin, glycitein, glycitin, 6”-O-acetylglycitin and 6”-O-malonylglycitin was established for measuring the 12 isoflavones in soybean eds and its processing products. The procedure includes the following key points: 80% methanol aqueous solution under ultrasonication for 1 h at 50℃ was chon; for paration of the 12 isoflavone components within 15 min, the mobile pha of 0.1% acetic acid (V/V) aqueous solvent A and 100% methanol solvent B with the flow rate of
本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2006CB1017, 2009CB1184, 2010CB1259), 国家
高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA1001, 2009AA1011), 国家自然科学基金项目(30671266), 国家科技支撑计划项目(2006BAD13B05-7), 高等学校创新引智计划项目(B08025), 国家重点实验室开放基金项目(ZW2009005), 江苏博士后科研计划项目(0901045C), 江西科技支撑计划项目(2009BNB06700)和江西
在线日语翻译器教育科技项目(GJJ10672)和江西农业科技项目(Ny0901)资助。
*通讯作者(Corresponding author)：盖钧镒, E-mail: sri@njau.edu, Tel: 025-********
第一作者联系方式: E-mail:
Received(收稿日期): 2010-03-04; Accepted(接受日期): 2010-08-04.
第12期王春娥等: 大豆异黄酮组分HPLC快速分析技术及其在豆腐加工中的应用2063
2.0 mL min–1, injection volume at 10 μL, column temperature at 36℃ and detection wavelength at 254 nm were lected; and the linear gradient extraction of 0–2 min, 27% B (V/V)→2−3 min, 27−38% B→3–10 min, 38% B→10–12 min, 38–39% B→12–14 min, 39% B→14–15 min, 39%–27% B was adopted. The procedure was linear (R2 = 0.9976–0.9999), preci (CV or RSD ranged from 0.90% to
3.35% for 2 232 samples from NJRIKY), accurate [recoveries were more than 99.00% for the different concentra-tions of the 12 isoflavones (CV of 0.22%–1.40%)], robust (inter-day CV of 0.24%–3.95%) and rapid (less than 15 min for 12 isoflavones resolved). The procedure was verified to be effective by a large sample determination of isoflavone components in soybean ed, soymilk and tofu using the soybean population of NJRIKY. The data indicated that the isoflavones were 3 695.00 μg g–1 in ed, among them 1
4.85% (548.88 μg g–1) were transferred to the residual, 8
5.15% (3 14
6.12 μg g–1) to soymilk, but only 1
7.32% (639.89 μg g–1) to tofu while 67.83% (2 506.23 μg g–1) to whey under the traditional tofu processing with CaSO4 as coagulant. The 12 isoflavone components in soymilk was somewhat less than tho in eds with 6”-O-Malonylgenistin the high-est in the both, while in tofu 6”-O-Acetylgenistin and 6”-O-Acetylglycitin were deficient but with high contents of genistein and daidzein. In addition, there was an enlarged genetic variation of the 12 isoflavone components among the lines, indicating the incread genetic potential for quality improvement due to recombination betwee
n Kefeng 1 and Nannong 1138-2.
Keywords: Soybean; Isoflavone component; High performance liquid chromatograph (HPLC); Gradient elution; Soymilk; Tofu
大豆异黄酮是重要的植物保护素, 由大豆苷元、大豆苷、乙酰基大豆苷、丙二酰基大豆苷、染料木苷元、染料木苷、乙酰基染料木苷、丙二酰基染料木苷、黄豆苷元、黄豆苷、乙酰基黄豆苷和丙二酰基黄豆苷等12种组分组成, 是大豆及其制品的重要保健成分。越来越多的研究表明大豆异黄酮具有降低胆固醇含量、预防前列腺癌与乳腺癌及骨质疏松、减轻更年期综合症等生物功效[1-7]。但不同组分其功效有差异[4-7], 近期报道认为黄豆苷类成分的功效更好[5-6]。因此大豆及其制品中异黄酮组分的准确测定是大豆品质育种及大豆制品加工业的基础之一。
已报道的大豆异黄酮定量分析技术主要有高效液相色谱法[8-20](high performance liquid chromato-graph, HPLC)与液-质联用法[21-22](HPLC-MS)。后者具有高分离、高分辨能力、高灵敏度等优点, 但仪器费用高, 不便于大批量样品测定。前者具有分离效果好、重现性好、准确度高、分析速度快、自动化程度高等优点, 被广泛采用。但目前多数文献报道HPLC分析技术仅可测得部分异黄酮[9-15], 而且异黄酮提取基本是在较高温度[11-16]和较强酸度[9,11,14-16]下进行, 致使丙二酰型异黄酮在提取时遭到破坏, 不能得到其真实含量。Wang等[8]、Jackson 等[19]和孙君明等[20]利用HPLC常规技术测定12
种异黄酮组分, 但样品异黄酮提取时间(>120 min)与色谱检测时间(>60 min)均较长; Rostagno等[18]建立利用整体色谱柱(monolithic columns) HPLC技术可在10 min内使12种异黄酮分离, 但目前其柱效稳定性还未确定, 不仅价格昂贵, 且难购买。大豆异黄酮育种和豆制品加工业需要对大批量的大豆种质及加工产品进行异黄酮12种组分快速、准确的定量分析。理想的测定技术要求提取充分、分离快、结果准确、重复性好、成本低。已报道的大豆异黄酮12种组分同
时准确测定程序复杂[8,21], 周期长[20], 成本高[18,21-22], 难以实现大批量样品快速定量检测。
因为异黄酮的保健功能, 国际上商品豆腐包装
均标注有豆腐中异黄酮的含量, 以表明豆腐的营养
the tower囯保健品质。中国是传统豆制食品的加工与消费大,
商品豆腐的品质评价还主要集中在口感与色度上,
迄今还没有对其内含营养成分大豆异黄酮进行标识,
大豆异黄酮研究也还集中在部分豆制品样品含量的
汉普森检测上, 也未见高含异黄酮豆腐加工专用品种的报
道。因此, 查明豆腐加工中异黄酮总量和组分的动
向, 对改进豆腐加工技术、遗传改良加工专用品种,
实现我国豆腐类食品大豆异黄酮含量标识化具有实
际意义。
本研究在前人研究基础上, 采用常规色谱柱
(packed columns) (Zorbax SB-C18柱, 5 μm, 4.6 ID× 150 mm) HPLC分析技术, 改进样品制备(即样品中异黄酮的提取或样品预处理或前处理)方式, 优化色谱条件, 缩短检测时间, 降低分析成本, 建立适于大批量样品12种异黄酮组分定量分析流程。在此基础上利用科丰1号×南农1138-2衍生的重组自交系群体(NJRIKY)研究其豆乳和豆腐加工前后12种异黄酮组分的变化, 为大豆异黄酮育种与豆制品加工技术的改进提供依据。
1材料与方法
1.1供试材料与田间试验
异黄酮HPLC分析技术改进所用的试验材料为南
农95C-13, 取自2004年的一项资源的随机区组试验。
豆腐加工前后异黄酮组分变化研究所用材料为
科丰1号×南农1138-2衍生的184个重组自交家系
(NJRIKY)及其亲本。该组材料遗传基础控制在2个
2064作物学报第36卷
亲本而又有充分的重组变异, 家系和群体都是良好的试材。2004和2005年连续2年夏季在国家大豆改良中心试验站种植, 完全随机区组设计, 3次(2004年)或4次(2005年)重复, 3行区, 行长2 m, 行距0.5 m, 条播。重复间田间表现相对一致, 故取其中一次重复的种子进行分析。
1.2主要仪器与试剂
Agilent 1100型高效液相色谱系统(Agilent Technologies, USA)(包括四元泵(G1311A)、在线真空脱气机(G1322A)、DAD检测器(G1315B)、柱温箱(G1316A)、自动进样器(G1313A))、Zorbax SB-C18柱(5 μm, 4.6 ID× 150 mm) (Agilent Technologies, USA)、1.5 mL色谱自动进样小瓶(Agilent Tech-nologies, USA)、Milli-Q超纯水系统(Millipore, USA)、离心机(BECKMAN Coulter Avanti J-25I, USA)、KQ-300
DB型数控超声波清洗器(中国昆山市超声仪器有限公司)、多头控温搅拌器(江苏省金坛市环宇科学仪器厂, 30磁头)、分析天平(Sartorius BS 2000S, Germany)、有机相针式滤器(13 mm × 0.45 μm)(ANPEL, 中国上海)、移液器(GILSON S.A.S., France)。
甲醇(HPLC级, Merck, Germany)、乙酸(HPLC 级, TEDIA, USA)、超纯水(Milli-Q纯水系统)。标准品来源与含量见表1。
1.3标准储备液与混合标准溶液的配制
1.3.1 标准储备液以少量甲醇分别将上述12个标准品溶解, 转至12个10 mL容量瓶, 甲醇定容, –20℃保存备用。1.3.2 混合标准溶液取12种单标储备液各1 mL 于25 mL容量瓶, 以甲醇定容, –20℃保存备用。
1.4 样品制备plagiarism
准确称取经FOSS样品磨50 s磨碎的大豆南农95C-13、NJRIKY籽粒干豆粉0.10 g (另取0.10 g于铝盒置125℃烘箱烘至恒重测定含水量, 湿豆腐1.00 g、生豆乳2.0 mL[23]), 置15 mL离心管, 以80%甲醇溶液定容至10 mL (料液比1∶100), 于50℃超声(频率40 kHz, 功率300 W)辅助提取 1 h, 经14 800 ×g离心10 min, 取上清液约1 mL过0.45 μm 滤膜(有机相针式滤器)注入Agilent自动进样专用小瓶(1.5 mL), –20℃保存待上机检测。
1.5色谱条件
色谱柱为Aglient Zorbax SB-C18柱(4.6 mm ID×150 mm, 5 μm); 柱温36℃; 进样量10 μL; 流动相为0.1% (V/V)乙酸水溶液(A)和100%甲醇(B); 流速2 mL min–1; 以0~2 min 27% B (V/V), 2~3 min 27%~38% B, 3~10 min 38% B, 10~12 min 38%~39% B, 12~14 min 39% B, 14~15 min 39%~27% B梯度洗脱; 柱后3 min (样品洗脱分离后让流动相A和B按起始浓度运行冲洗色谱柱3 min, 以备检测下一个样品); 检测波长为254 nm (DAD)。
1.6大豆异黄酮12种组分鉴定指标
以每1 g干大豆籽粒中或1 g干大豆籽粒加工产品中异黄酮的量为鉴定指标(单位为μg g–1)。异黄酮总含量或异黄酮含量(TISF或ISF)指大豆异黄酮12种组分的总和。豆渣异黄酮含量=籽粒异黄酮含量－豆乳异黄酮含量, 黄浆水异黄酮含量=豆乳异黄酮
表1大豆异黄酮12种组分的标准样品
Table 1 Name and standards of 12 isoflavone components
异黄酮组分Isoflavone component 代号
Code
标准样品来源与含量
Source and content of standards
大豆苷元 Daidzein De Fluka, Sigma-Aldrich Co. USA, ≥98% 大豆苷 Daidzin D Fluka, Sigma-Aldrich Co. USA, ≥95% 乙酰基大豆苷 6”-O-Acetyldaidzin AD FUJICCO, Japan, ≥90%
丙二酰基大豆苷 6”-O-Malonyldaidzin MD FUJICCO, Japan, ≥90%
染料木苷元 Genistein Ge Sigma, Sigma-Aldrich Co. USA, ≥98% 染料木苷 Genistin G Fluka, Sigma-Aldrich Co. USA, ≥99% 乙酰基染料木苷 6”-O-Acetylgenistin AG FUJICCO, Japan, ≥90%
丙二酰基染料木苷 6”-O-Malonylgenistin MG FUJICCO, Japan, ≥90%
黄豆苷元 Glycitein GLe Sigma, Sigma-Aldrich Co. USA, ≥97% 黄豆苷 Glycitin GL FUJICCO, Japan, ≥95%
top of the world乙酰基黄豆苷 6”-O-Acetylglycitin AGL FUJICCO, Japan, ≥90%
丙二酰基黄豆苷 6”-O-Malonylglycitin MGL FUJICCO, Japan, ≥90%
could
第12期王春娥等: 大豆异黄酮组分HPLC快速分析技术及其在豆腐加工中的应用2065
含量－豆腐异黄酮含量。以下试验样品制备、色谱条件与鉴定指标无说明时均与上同。
1.7 HPLC分析技术的试验设计
试验1为样品前处理, 以大豆南农95C-13籽粒干豆粉为试样, 设置12个处理即80%甲醇/水分别室温振荡提取30 min (处理T1, 以下类推)、60 min (T2)与90 min (T3); 室温超声30 min (T4)、60 min (T5)与90 min (T6); 50℃超声30 min (T7)、60 min (T8)和90 min (T9)与80 ℃超声30 min (T10)、60 min (T11)和90 min (T12), 用于测定提取对各种大豆异黄酮提取含量的影响。试验重复3次。
试验2为流动相的确定, 以混合标准溶液为试样, 设计8种不同流动相对大豆异黄酮分离程度的影响，分别为(1)水(A)、80%甲醇/水(B); (2)水(A)、80%乙醇/水(B); (3) 0.1%醋酸/水(A)、80%甲醇/水(B);
(4)0.1%醋酸/水(A)、80%乙醇/水(B); (5)水(A)、100%甲醇(B); (6)水(A)、100%乙醇(B); (7)0.1%醋酸/水(A)、100%甲醇(B); (8) 0.1%醋酸/水(A)、100%乙醇(B)。
试验3为柱温, 以混合标准溶液为试样, 比较柱温分别为室温、24、26、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54和56℃对异黄酮12种组分分离程度的影响。
试验4为洗脱梯度, 试验21种(略)洗脱方式对异黄酮12个组分分离程度的影响。
试验5为准确度, 分别以4种不同的混合标样(方案见表5的“加入量”)加入南农95C-13试样中, 比较其回收率, 确定提取的准确度。试验重复3次。
试验6为精确度与稳定性, 以大豆品种南农95C-13籽粒干豆粉为试样, 测定大豆异黄酮12个组分日内5次重复(重复间间隔4 h)、连续3日间(每日重复3次的均值间, 重复间间隔4 h)稳定性。
试验7以NJRIKY家系及其亲本2004年和2005年籽粒与其加工产品为材料, 检测12种异黄酮组分, 考察优化后HPLC分析方法的精确性, 分析豆乳和豆腐加工前后异黄酮组分的变化。试验重复2次。
1.8数据分析
(1) 应用ChemStation Rev. A. 08.03软件, 依据12种异黄酮标准样品的洗脱时间和最大吸收光谱定性, 以在DAD 254 nm波长的吸收光谱下吸收值为基础, 根据标准曲线计算样品中的各个异黄酮组分的准确含量。
(2) 参考《试验统计方法》[24], 采用SAS 9.0 MEANS程序进行联合统计分析, CORR程序进行相关分析。pourquoi
awv
2结果与分析
2.1 大豆异黄酮组分HPLC快速分析流程的建立2.1.1 提取条件的比较和选择文献报道的异黄酮提取方法较多, 主要为在高温[11-16]或室温[20]下的酸[8-9,11,14-16,20]提取、搅拌振荡下的盐酸乙腈[8-9]混合液或甲醇[12-13]提取、超声下的甲醇[12-13,17]或乙醇[18]或酸[14]提取等。高温、强酸均会降解丙酰基类异黄酮, 自然条件下则可能提取时间长或不能充分提取, 影响异黄酮测定结果的准确性。试验1结果(表2)表明80%甲醇/水50℃超声60 min (T8)、90 min (T9), 80℃超声60 min与90 min (T12)均具有较高的提取率(表2粗体部分), 但80℃超声乙酰基与丙酰基类异黄酮含量下降, 加标回收率异常(表3), 均低于93% (可能是温度太高导致乙酰基与丙酰基类异黄酮组分降解所致), 50℃超声90 min(T9)的提取率总量略高于50℃超声60 min (T8), 但未至显著水平, 且仅80%甲醇/水50℃超声60 min(T8)的12种异黄酮加标回收率均大于99%(表3), 与金米聪等[22]超声的最佳时间与温度不一致, 可能是溶剂与超声仪功率差异所致。因此选择80%甲醇/水50℃超声60 min 提取(T8)。
2.1.2 色谱条件的比较和选择以下试验均以12种异黄酮标准品配制的混合标样为试样。
(1) 检测波长：通过DAD在线扫描, 扫描范围为200~400 nm, 结果12种大豆异黄酮的最大吸收波长均在254 nm附近, 与Klejdus等[12-14,18-19]结果相同。因此选择DAD检测波长为254 nm。
(2) 流动相: 试验2结果表明, 处理(3)、(4)、(7)和(8) 4种流动相均能使12种大豆异黄酮获得较好的分离, 其中处理(7)分离效果最理想(图1-C), 与Cesar等[14]结果相同。因此选取处理(7) 0.1%醋酸/水(A)、100%甲醇(B)为试验流动相。
(3) 柱温: 试验3结果表明, 柱温46℃时(图1-B), 12种异黄酮虽较快较好分离, 但第3种组分(G)峰未出完基线已出现漂移现象; 柱温56℃时基线严重漂移(图1-A); 柱温26℃时(图1-D), 基线平稳, 但15 min内, 第12种组分(Ge)峰未出完; 柱温36℃时分离效果最理想(图1-C, 图2-C), 与Klejdus等[12]结果一致。因此选取检测柱温为36℃。
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作 物 学 报
第36卷
表2 不同提取条件的异黄酮组分含量
Table 2 Contents of isoflavone components under different extraction conditions (μg g –1)
组分 Isoflavone
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
T11 T12 De 1.38 16.7617.01 13.3311.5818.3013.6219.6334.63 59.59 259.23292.03D 104.32 121.06
115.65 135.91110.27146.53147.09348.58338.25 354.46 392.50422.79AD 7.02 10.437.43 19.058.267.5910.418.3627.90 4.97 57.0344.30MD 247.99 298.94304.51 323.46279.25400.54392.22938.71804.01 254.48 703.24541.01Ge 7.57 11.8820.42 5.8712.7611.6218.3720.3275.31 24.20 27.1389.99G 206.77 186.70214.80 217.82220.76244.73254.97532.95522.64 254.98 502.08590.63AG 45.82 8.3638.10 51.15100.6940.28125.9593.79169.44 94.00 51.39120.87MG 663.40 675.63707.90 745.66727.36792.51840.001942.381888.34 1620.15 1643.95
1518.81GLe 5.97 8.698.68 5.068.38 4.63 4.8219.0926.76 33.79 100.78212.59GL 114.80 108.19123.89 119.93115.65126.48140.16167.95275.15 245.16 270.92177.09AGL 14.40 24.6630.55 25.6038.3948.5258.2732.9937.00 46.79 20.9127.57MGL 148.57 151.18168.48 164.65
155.60
192.68215.71409.75389.78
283.28
390.94
321.43TISF 1568.00 1622.50
1757.44 1827.481788.972034.42
2221.59
4534.51
4589.20 3275.85 4420.10
4359.13
T1, T2, ……, T12分别代表12个处理, 详见正文。粗体为异黄酮提取含量较高的处理; TISF 为异黄酮各组分总和。
T1, T2, and T3 stand for shaking at room temperature for 30, 60, and 90 min in 80% methanol aqueous solution, T4, T5, and T6 denote ultrasonication at room temperature for 30, 60, and 90 min, T7, T8 and T9 denote ultrasonication at 50℃ for 30, 60, and 90 min, T10, T11, and T12 denote ultrasonication at 80℃ for 30, 60, and 90 min, respectively. Boldface indicates the treatments with higher extractions of isoflavone components; TISF stands for the total contents of 12 isoflavone components.
表3 不同提取条件的回收率
Table 3 Recovery under different extraction conditions
测定值 Measured value (μg mL –1)
回收率 Recovery (%)
组分Component
加入量
Addeda mount (μg mL –1)
T8 T9 T11 T12
T8
T9 T11 T12
De 18.00 18.27 19.21 20.21 19.38 101.49 106.74 112.29 107.66D 20.00 19.92 20.32 20.32 21.71 99.订书机英文
59 101.61 101.61 108.55AD 20.00 19.87 20.36 18.36 15.77 99.37 101.79 91.79 78.85MD 20.00 20.13 17.70 18.00 16.22 100.65 88.50 90.00 81.10Ge 20.00 19.94 21.72 21.72 20.19 99.68 108.61 108.61 100.95G 20.00 20.06 20.56 20.56 21.88 100.31 102.80 102.80 109.41AG 20.00 20.31 20.13 17.13 13.67 101.54 100.66 85.66 68.37MG 20.00 19.85 17.74 14.74 14.89 99.26 88.72 73.72 74.44GLe 12.80 12.80 13.78 13.78 11.77 100.04 107.62 107.62 91.96GL 40.00 39.92 41.10 41.10 38.62 99.79 102.76 102.76 96.54AGL 20.00 19.94 18.47 16.47 15.57 99.69 92.36 82.36 77.87MGL
20.00
19.83 17.53 14.53 16.40 99.13
87.67 72.67 82.01
粗体为异黄酮回收率最高的处理。
Boldface indicates the extraction condition with highest recovery.
(4) 流速: 试验了0.5~3.0 mL min –1范围的多种流速对大豆异黄酮分离的影响, 结果表明流速 2.0 mL min –1时分离效果最理想。因此选取检测流动相流速2.0 mL min –1。
pepsico
(5) 洗脱梯度: 试验了21种洗脱方式发现, 同一流动相洗脱梯度细微的差异, 将导致12种异黄酮组分不同的分离结果(图2)。0~2 min 27% B (V/V ), 2~3 min 27%~38% B, 3~10 min 38% B, 10~12 min
38%~39% B, 12~14 min 39% B, 14~15 min 39~27% B 的洗脱梯度, 12种大豆异黄酮15 min 内得到理想的分离效果(图2-C), 因此, 以此洗脱梯度作为检测12种异黄酮色谱流动相的洗脱方式。
2.1.3 标准工作曲线及检出限 12种大豆异黄酮均具有良好的线性(表4), 相关系数r 均大于0.999, 保留时间的CV (RSD , relative standard deviation or coefficient of variation)为0.11~0.12, 其检测限与定
