作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(12): 2174 2179 www.chinacrops/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@chinajournal
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.02174
大豆GmTINY1基因的克隆与表达分析
黄方何慧迟英俊盖钧镒喻德跃*
南京农业大学国家大豆改良中心/作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095
摘要: 采用基因芯片技术, 从大豆中鉴定了一个荚优势表达基因。利用生物信息学的方法, 拼接了该基因的全长序列, 并通过RT-PCR克隆了该基因。Blast检索分析表明, 该基因编码一个具有AP2结构域的转录因子, 且与拟南芥DREB类蛋白TINY的氨基酸相似度最高, 将该基因命名为GmTINY1。GmTINY1包含一个735 bp的开放阅读框, 编
码244个氨基酸残基。GmTINY1与拟南芥TINY和TINY2蛋白的相似度分别为59%与62%。系统发生分析表明, GmTINY1、TINY和TINY2位于一个分支, 且同属于DREB亚家族。实时定量RT-PCR检测表明, GmTINY1基因在
荚中高丰度表达, 在花中的表达量也较高, 在根中的表达量较低, 而在叶片中未检测到表达。基因芯片信息分析结果
表明, GmTINY1在种子发育的子叶期的种脐部分高丰度表达。由此推论, GmTINY1基因在大豆生殖器官发育中可能发
挥调控作用, 可能与种子发育过程中种脐的形成有关。
关键词: 大豆；转录因子；AP2；TINY；DREB
Cloning and Characterization of GmTINY1 Gene in Soybean (Glycine max)
HUANG Fang, HE Hui, CHI Ying-Jun, GAI Jun-Yi, and YU De-Yue*
National Center for Soybean Improvement / National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural Univer-sity, Nanjing 210095, China
Abstract: Plant reproductive development involves the coordination of a lot of genes encoding transcription factors. The AP2 domain transcription factors have been proved with critical roles in plant reproductive development. By microarray analysis, we identified a gene which showed higher e
xpression in pod as 500 folds as that in leaf of soybean. The Blast arches indicated this gene encodes a dehydration responsive element binding protein (DREB)-like protein showing highest similarity to Arabidopsis TINY, therefore named as GmTINY1. By arching soybean genome and EST databas, the putative full-length cDNA quence for GmTINY1 was in silico asmbled. The GmTINY1 gene was cloned from soybean eds at 15 DAF (days after flowering) by RT-PCR. GmTINY1 contained a complete open reading frame (ORF) of 755 bp which encoded a peptide of 244 amino acids. The predicted molecular mass and isoelctric point of GmTINY1 are 26.76 kD and 5.12, respectively. An AP2 domain and a Ser-rich domain were identified in GmTINY1 amino acid quence by Motif Scan rver. The GmTINY1 encoding product showed 59% and 62% quence similarities with Arabidopsis TINY and TINY2, respectively. Multiple quences alignment revealed that a highly conrved AP2 domain was prent in each AP2 domain transcription factor. In this AP2 domain, it was found that a Ser66 was specifically prent in GmTINY1, DREB1B, TINY and TINY2 proteins but a Cys66 in DREB1A and DREB1C proteins, in-dicating, like Arabidopsis TINY, TINY2 and DREB1B, GmTINY1 might be able to bind both the dehydration responsive ele-ment(DRE) and ethylene responsive element (ERE) motifs while DREB1A and DREB1C only bind DRE motif. Besides, it was found that a Ser-rich domain probably involving translational modification on GmTINY1 protein was located clo to AP2 do-main. The neighbor-joining phylogenetic tree sho
wed that the AP2 domain transcription factors were grouped into four subfami-lies: DREB, ERF, AP2, and RA V; and GmTINY1, TINY, and TINY2 were grouped into a branch which attributed to the DREB subfamily. With an attempt to understand the biological role for GmTINY1 and to verify the microarray result, we ud the Real-time quantitative PCR approach to analyze the expression pattern of GmTINY1 in various soybean organs. We found that expression of GmTINY1 was the highest in pod, relatively lower in flower and root, but undetectable in leaf, indicating that GmTINY1 may play some roles in soybean reproductive organs and root, but not in leaf. The Blast arch results against soybean
本研究由国家自然科学基金项目(30771362和30800692)，教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目(200803071018)，江苏省自然科学基金项目(BK2008334)和南京农业大学青年创新基金项目(KJ08002)资助。
*通讯作者(Corresponding author)：喻德跃, E-mail: dyyu@njau.edu
第一作者联系方式: E-mail: fhuang@njau.edu
Received(收稿日期): 2009-04-23; Accepted(接受日期): 2009-07-21.
第12期黄方等: 大豆GmTINY1基因的克隆与表达分析2175 EST databa also supported the specific expression of GmTINY1 in soybean pod and root. We analyzed GmTINY1 expression during the cour of ed development bad on publicly available microarray data and found that GmTINY1 was expresd with a low level at the globular stage and heart stage but highly expresd in hilum at the cotyledon stage embryos. Taken together, it is suggested that GmTINY1 may play some regulatory role in soybean reproductive development, such as the formation of hilum in soybean.
Keywords: Soybean; Transcription factor; AP2; TINY; DREB
植物生殖器官的发育是一个非常复杂的、由多基因协调控制的过程。目前的研究表明植物中多种转录因子参与了生殖器官的发育过程, 如MADS- box转录因子, AP2类转录因子、锌指蛋白等。植物AP2类转录因子得名于花发育过程中起重要作用的转录因子基因AP2[1-2]。植物AP2类转录因子具有众多的家族成员, 根据其结构和功能可分为5个亚家族, 如AP2亚家族, 含有2个AP2结构域, 在植物的生殖发育过程中发挥着重要作用；RAV亚家族, 含有AP2和B3 2个不同的DNA结合结构；DREB 亚家族, 含有1个AP2结构域, 与植物的抗逆反应密切相关；ERF亚家族, 含有1个AP2结构, 作为乙烯响应因子参与了植物的抗病反应等多种生命活动[3-4]。然而有些AP2类转录因子同时参与了植物的抗逆反应以及生殖器官的发育过程, 比如拟南芥DREB亚家族成员TINY, 不仅通过脱水应答元件参与了拟南芥的抗逆反应, 也通过控制细胞的大小, 控制花丝和雌蕊的长度[5-6]。
目前对植物生殖器官发育分子机制的研究多集中在拟南芥等模式植物和一些园艺植物中, 对于农作物也多集中在单子叶植物, 如水稻, 而对豆科植物的研究很少。但豆科植物在世界范围内的农业重要性仅次于禾本科作物。大豆作为重要的豆科植物, 其高蛋白、高油含量一直在人类和动物的营养中占有特殊而重要的地位, 而有关其生殖器官发育的分子基础研究还相对滞后。大规模基因芯片分析技术加速了大豆生殖器官发育的分子生物学研究。Haerizadeh等[7]利用基因芯片技术分析了大豆花粉的转录组, 表明7.87%的大豆基因在花粉中优势表达。本实验室通过基因芯片技术分析了大豆荚的转录组, 揭示 2.30%的大豆基因在荚中优势表达(未发表资料)。本研究通过基因芯片技术结合RT-PCR, 分离了一个大豆荚优势表达的拟南芥TINY转录因子同源基因GmTINY1。检测了GmTINY1基因在根、叶、花以及荚中的表达, 并分析了该基因在大豆种子发育过程中的表达特征。
1 材料与方法
1.1试验设计
大豆[Glycine max (L.) Merr.]品种Jackson由南京农业大学国家大豆改良中心种质资源研究室提供, 于正常季节种植于南京农业大学网室。参考Huang 等的方法[8], 种植和收获试验材料。分别收集大豆六复叶期的根和叶, 大豆盛花期(R1)花和花芽的混合物, 大豆初荚期(R3)的荚立即以液氮速冻, 于–80℃冰箱中保存备用。
1.2 RNA提取与cDNA第一链合成
采用Trizol试剂(Invitrogen, USA)提取大豆不同组织总RNA, 经过DNa I (TaKaRa, 大连)处理后进行cDNA第一链的合成(Promega, USA)。
1.3 GmTINY1基因的克隆
利用大豆基因芯片探针GmaAffx.18649.1.S1_at 的核苷酸序列搜索大豆基因组数据库(www. phytozome/soybean)。将匹配的基因组序列利用FGENESH程序(/)进行开放阅读框的预测。以预测产物为探针, 搜索大豆dbEST 数据库, 验证预测的准确性。最后利用BioXM(Ver.
yumei2.6)设计覆盖完整开放阅读框的引物序列GmT5: 5'-ATGAGAGTTTCCACCCAGAA-3', GmT3: 5'-T CAGTAGTCCCACAGAAAAC-3'。利用大豆开花后15 d的嫩种子cDNA为模板进行PCR扩增, 程序为95℃变性4 min, 94℃变性50 s , 56℃复性50 s, 72℃延伸1 min, 共计30个循环, 最后72℃延伸10 min。PCR产物经胶回收后连接至pGEM-T载体, 进行序列测定。
财务会计学1.4 实时定量RT-PCR
以大豆组成型表达Actin基因(GenBank登录号为V00450)为内部参照, 参考Huang等[9]的步骤进行实时
定量RT-PCR。通过比较C T的方法进行基因表达水平的相对定量分析。以GmTINY1基因为目标基因(target gene), 它在花、根和荚中相对于叶组织的相对表达量fold change = 2–△△C T, 此处∆∆C T = (C T, GmTINY1 – C T, actin) flower or root or pod
– (C T, GmTINY1 – C T, actin)leaf。手机学英语
1.5 GmTINY1基因表达的基因芯片分析
利用已经公布的大豆种子发育过程中的基因芯片数据(estdb.biology.ucla.edu/ed/; www. ncbi.v/geo), 搜索大豆GmTINY1基因(探针号为GmaAffx.18649.1.S1_at)在大豆发育3个阶段(球形胚期、心形胚期和子叶期)中的基因表达数据。
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1.6 生物信息学分析
GmTINY蛋白的分子量和等电点由BioXM程序(Ver. 2.6, home.njau.edu/~bioxm)预测；Motif Scan程序(hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)用于搜寻GmTINY1序列中的可能基序；多序列比对由Clustalx程序(Ver. 1.83)和GeneDOC程序(Ver. 2.6)进行；MEGA程序(Ver. 4.0)用地系统发生分析。
2结果与分析
2.1 大豆GmTINY1基因的克隆与序列分析
为了研究大豆荚的转录组组成, 通过基因芯片技术比较大豆叶片和荚的基因表达差异并从中鉴定了一个新的大豆AP2类转录因子基因(探针编号为GmaAffx.18649.1.S1_at), 其在大豆荚的表达量为叶的500倍。以该探针序列搜索已经公布的大豆基因组数据库, 并将匹配的基因组序列通过FEGENESH
图1 大豆GmTINY1基因的扩增结果
Fig.1 PCR amplified products of GmTINY1
1~2: PCR产物；M: 分子量标准DL2000；箭头示PCR产物条带。
1 2: PCR products; M: molecular marker DL2000. Arrow indicates
the PCR band.
图2 GmTINY1与拟南芥AP2蛋白的多序列比对
Fig. 2 Amino acid alignment of GmTINY1 with veral Arabidopsis AP2 proteins
下画线处为保守的AP2结构；星号表示AP2结构内存在差异的位点；加框处表示TINY蛋白特有的富含丝氨酸区。用于多序列比对的AP2蛋白分别为大豆GmTINY1，拟南芥TINY[5-6]和TINY2[10]，拟南芥DREB1A、DREB1B和DREB1C[11-12]。
The AP2 domains and TINY protein-specific Ser-rich regions are underlined and boxed, respectively. The differential sites within AP2 do-main are marked by stars. The proteins ud for alignment are soybean GmTINY1, Arabidopsis TINY, TINY2[5-6], DREB1A, DREB1B, and
DREB1C[11-12].
第12期黄方等: 大豆GmTINY1基因的克隆与表达分析2177
程序进行开放阅读框的预测。得到1个包含735 bp 的开放阅读框(ORF)。进一步设计PCR引物GmT5和GmT3, 通过RT-PCR的方法从大豆荚中克隆了包含完整ORF的基因产物(图1), 将其命名为GmTINY1。序列分析表明, GmTINY1基因编码244个氨基酸残基, 预测分子量为26.76 kD, 等电点为5.12。通过Motif Scan程序分析, 鉴定出了位于51~110位的AP2功能域以及1个富含丝氨酸的区域(图2)。
amoeba
2.2多序列比对与系统发生分析stevejobs
以GmTINY1的氨基酸序列为信息探针, 用Blast程序检索GenBank的NR数据库, 从拟南芥、水稻、大豆、葡萄、紫花苜蓿等植物中鉴定了多个TINY类似蛋白, 表明TINY蛋白普遍存在于高等植物中。将拟南芥的2个TINY蛋白TINY[5-6]和TINY2[10]以及3个DREB1蛋白DREB1A、DREB1B 和DREB1C[10-11]进行多序列比对, 发现AP2结构域在所有比对的蛋白中高度保守, 但其他区域的氨基酸序列相似性较低(图2)。GmTINY1与TINY和TINY2蛋白的相似性较高, 分别为59%与62%；因同属DREB亚家族, GmTINY1与DREB1蛋白的氨基酸相似度也达到了41%~42%。在TINY类蛋白中, 在AP2结构后面还存在1段富含丝氨酸的区域(图2)。此外, 在保守的AP2结构域内, 也存在7个不同的氨基酸位点(图2)。
为了进一步研究GmTINY1蛋白与其他AP2类蛋白的亲缘关系, 利用MEGA软件, 构建了包含GmTINY1以及其他AP2蛋白的系统发生树(图3)。将用于分析的植物AP2蛋白分为DREB亚家族、ERF 亚家族、AP2亚家族和RAV亚家族4类。因为DREB 和ERF亚家族均含有1个AP2结构, 将二者并为1个大的分支。在DREB亚家族中, GmTINY1与拟南芥TINY和TINY2聚集为1个小的分支, 表明它们具有有较近的亲缘关系, 这与多序列比对的结果是一致的。
2.3 GmTINY1基因在大豆不同器官中的表达分析
利用实时定量RT-PCR技术, 检测了GmTINY1基因在大豆根、叶、花和荚中的mRNA水平的表达。结果表明, 与基因芯片分析的结果一致, GmTINY1基因在大豆荚中的表达远高于叶片中(图4-A和B)。此外, GmTINY1基因在大豆花中的表达量也较高, 但在根部的表达量较低(图4-B)。说明GmTINY1基因主要在生殖器官中发挥作用, 在根部也行使一定的功能。
图3 GmTINY1与其他植物AP2蛋白的系统发生分析
Fig. 3 Phylogenetic analysis of GmTINY1 and other plant
species AP2 domain proteins
邻近法构建的系统发生树由MEGA程序绘制。用于系统发生树构建的植物AP2蛋白如下：大豆GmDREB2[13]、GmDREB3[14]、GmSGR[15]、GmEREBP1[16]、拟南芥AtERF1、AtERF2[17]、AP2[1-2]、SNZ(AT2G39250)、RA V1和RA V2[18]。
未分配利润怎么算The neighbor-joining phylogenetic tree was constructed by MEGA program. The proteins ud for tree construction are soybean GmDREB2[13], GmDREB3[14], GmSGR[15], GmEREBP1[16], Arabidopsis AtERF1, AtERF2[17], AP2[1-2], SNZ(AT2G39250), RA V1, and RA V2[18]. 2.4GmTINY1基因在大豆种子发育过程中的表达分析
由于GmTINY1基因在大豆荚中高丰度表达, 推测其可能在种子发育的过程中发生作用。因此利用已经公布的大豆基因芯片数据, 分析了GmTINY1基因在种子发育不同阶段的种子不同部位中的表达(图4)。结果表明GmTINY1基因在球形胚期和心形胚期不同器官中的表达量都较低, 但在子叶期的种脐部位的表达量明显高于其他组织, 表明GmTINY1基因在种脐的形成过程中可能发挥了一定的作用。
3讨论
本研究从大豆中克隆了一个荚优势表达的AP2类转录因子基因。其编码产物与拟南芥TINY蛋白相似度最高, 故被命名为GmTINY1。多序列比对结果表明, 在GmTINY1与拟南芥TINY、TINY2和DREB1转录因子的AP2结构域中存在7个显著不同的氨基酸位点。值得注意的是, TINY、TINY2、Gm- TINY1和DREB1B的第66位氨基酸残基都是Ser,
头皮屑多是什么原因2178
作 物 学 报 第35卷
personnel图4 GmTINY1基因的表达
Fig. 4 Expression analysis of GmTINY1
A: 大豆GmTINY1基因在叶片和荚中表达的基因芯片数据; B: 以实时定量RT-PCR 技术检测大豆GmTINY1基因在叶、根、荚 和花组织中的表达; C~E: GmTINY1基因分别在种子发育的球形胚期、心形胚期和子叶期的表达。
拂晓的意思A: microarray data for GmTINY1 expression in soybean leaf and pod; B: Real-time RT-PCR analysis of GmTINY1 gene expression in leaf, root, pod and flower; C–E: expression of GmTINY1 gene at globular embryos stage, heart embryos stage and cotyledon stage during ed
development, respectively.
而DREB1A 和DREB1C 的该位置氨基酸为Cys 。已有研究结果表明TINY, TINY2和DREB1B 都可以结合DRE 和ERE 元件[6], 而DREB1A 和DREB1C 只能结合DRE, 表明第66位的Ser 对于ERE 元件的识别具有重要的作用[6], 而GmTINY1也可能同时结合DRE 和ERE 元件。此外, 在TINY 蛋白的AP2结构域后还存在1个富含Ser 的区域(图2), 该区域可能与GmTINY1的翻译后修饰有关。
对于植物TINY 转录因子的生物学功能目前还知之甚少。在拟南芥中, 发现TINY 转录因子能够结合脱
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水应答元件DRE 和乙烯应答元件ERE, 其表达受高盐、低温、干旱、乙烯和茉莉酸甲酯的诱导, 且过量表达TINY 基因的拟南芥转基因植株能够激活
启动子区域含有DRE 或ERE 元件的下游基因的表
达[5-6]。除了参与胁迫响应之外, 人们还发现tiny 突变体表现出由于细胞减小而引起的植株矮小、胚轴缩短、雌蕊和花丝缩短、花药位置低于柱头等性 状[5]。而且施加赤霉素GA 3不能恢复tiny 突变体的植株高度, 表明tiny 并没有阻断赤霉素的合成[5]。已经证实, 拟南芥TINY 能够通过控制细胞的大小, 控制花丝、雌蕊的长度[5]。GmTINY1除在生殖器官中表达外还在根部表达, 但在叶片中没有检测到表达, 表明GmTINY1基因可能在根部发挥某种功能, 比如根部的器官发育、根部营养和水分的吸收等。拟南芥TINY 能够与脱水应答元件DRE 结合, 因而推测具类似序列特征的大豆GmTINY1也可能结合脱水
