大豆子叶节离体再生体系优化研究
潘川芝，李凤，戴良英
(湖南农业大学生物安全科技学院，湖南长沙410128)
摘要：为获得大豆子叶节高效离体再生体系的优化方案，选用5个大豆品种的子叶节作为外植体，研究了种子萌发天数、外植体大小、不同激素浓度对大豆子叶节再生的影响。结果显示，大豆苗龄以5~7d最佳；外植体以保留全部子叶为宜；外植体的萌发和诱导均存在基因型差异,292黄豆的最佳萌发培养基为1/2MS+1mg/L6-BA，而鄂8157、湘春豆18号、湘春豆13号、湘春豆15号的最佳萌发培养基为1/2M S+2mg/L6-BA,292黄豆、鄂8157、湘春豆18号、湘春豆13号、湘春豆15号的最佳诱导培养基组合分别为MS+2mg/L6-BA、MS+2mg/L6-BA、MS+1mg/L6-BA、1/2MS+2mg/L6-BA+0.05mg/L IBA、MS+2mg/L6-BA，丛生芽诱导率分别为60%、62.5%、81.25%、77.27%和47.5%。子叶节丛生芽生根时IBA浓度以2mg/L为宜。
关键词：大豆；子叶节；丛生芽；再生体系
中图分类号:S188.21文献标识码:A文章编号:1006-060X(2006)05-0031-02
Regeneration System of Soybean Cotyledonary Nodes
PAN Chu an-zh i,LI Feng,DAI Liang-ying
(Bio-sa fety College of Science an d Technology,H unan Agriculture University,Changsha410128,PRC)
Abstract:The cotyledonary nodes were ud as explan ts from five excellen t culti vars,soybean292,e8157,Xiangchun18,X-i angchun13and Xiangchun15.Effects of edling ages,explant size and hormone combinations on shoot regeneration were stud-ied.The results showed that the germination mediu m1/2MS+1mg/L6-BA was the best for soybean292,while the medium1/ 2MS+2mg/L6-BA was fi t for the rest.The full cotyledonary is the best explant size for shoot differentiation.The best inductive mediums for soybean292,e8157,Xiangchun18,Xiangchun13and Xiangchun15were MS+2mg/L6-BA,MS+2mg/L6-BA,MS+1mg/L6-BA,1/2MS+2mg/L6-BA+0.05mg/L IBA and MS+2mg/L6-BA,respectively.The shoot regenera-tion percentage from cotyled ons of five cultivars reached60%,62.5%,81.25%,77.27%and47.5%,respectively.Seedling age from5to7days was the best.
Key words:soybean;cotyledonary node;multiple shoot;regenaration system
大豆再生体系包括体细胞胚胎发生途径的再生体系[1]、原生质体再生体系[2]、不定芽器官发生途径的再生体系等。其中大豆不定芽器官发生体系所用的外植体有无菌苗子叶节[3]、未成熟种子的子叶和茎尖[4]、无菌苗上胚轴[5]等。其中子叶节不定芽具有再生时间短，再生过程简单，易获得外植体等优点，因此以子叶节做为外植体的再生效果最好。但影响大豆子叶节再生的因素较多，需进行优化，以提高再生频率。
1材料与方法
收稿日期:2006-07-14
基金项目：湖南省优秀博士论文奖励基金(20031020)
作者简介：潘川芝(1963-)，女，湖南长沙市人，助理实验师，主要从事生物安全研究工作。1.1材料
供试材料为5个大豆品种：台湾292黄豆、鄂8157、湘春豆18号、湘春豆15号、湘春豆13号。1.2方法
1.2.1大豆无菌苗的获得选取饱满无病斑的大豆种子，用自来水洗净,75%酒精消毒1min，无菌水清洗2次后，再用0.1%升汞浸泡8~10min，无菌水冲洗5次，每次3~5min。消毒后的种子接种于萌发培养基，于26?1e，光暗培养14h/10h条件下培养。
1.2.2大豆子叶节丛生芽的诱导5~6d后，取出萌发的大豆种子。剥去种皮，保留2~3mm下胚轴，将子叶从下胚轴处切开，除去顶芽及腋芽后，将其置于诱导培养基上。每皿5个子叶，于26?1e,14h/ 10h光照条件下培养。约7d后，子叶节处有小芽
湖南农业科学2006,(5):31~32,36Hunan Agricultural Sciences
长出,14d后，选取有明显主茎的小芽进行丛生芽的统计。
1.2.3丛生芽诱导生根将分化出的丛生芽切下，接种于含不同IB A浓度的生根培养基上，每瓶5个外植体，培养15d，每个浓度3次重复。
1.2.4试管苗的移栽丛生芽生根后将瓶口打开炼苗3~4d，取出根系发达、生长健壮的试管苗，洗净根部培养基，移入菜土、细沙混合的土钵中，室温条件下培养，适量浇水、施肥。
2结果与分析
2.1萌发天数对丛生芽分化的影响
对台湾292黄豆外植体的观察显示，萌发6d 的外植体丛生芽诱导率最高，可达60%。萌发超过7d时，丛生芽诱导率随着萌发天数的增加而下降，萌发10d的外植体诱导率仅为20%。其原因可能是随着萌发天数的增加，子叶节分生组织的分生能力逐渐变弱，使丛生芽诱导更为困难。
2.2外植体大小对丛生芽分化的影响
4个品种当保留全部子叶和2/3子叶时，丛生芽诱导率和平均丛生芽数均不存在显著差异。而292黄豆外植体保留全部子叶时，丛生芽诱导率显著高于保留2/3子叶的外植体，且平均丛生芽数不存在显著差异。这说明不同外植体大小对子叶节丛生芽分化的影响不明显，从再生频率和试验的简便性考虑，宜选择保留全部子叶。
2.3不同萌发培养基对丛生芽分化的影响
如表1所示,5个大豆品种均以A培养基(不添加6-B A)的外植体丛生芽诱导率最低，说明在萌发培养基中添加微量6-BA可促进丛生芽的诱导。但不同的大豆品种存在基因型差异，最佳萌发培养基配方也不尽相同,292黄豆的最佳萌发培养基为1/2MS+1mg/L6-B A，而鄂8157、湘春豆18号、湘春豆13号、湘春豆15号的最佳萌发培养基则为1/2 MS+2mg/L6-BA。
2.4不同诱导培养基对丛生芽分化的影响
如表2所示,292黄豆、鄂8157、湘春豆18号、湘春豆13号、湘春豆15号的最佳诱导培养基配方分别为MS+2mg/L6-B A、MS+2mg/L6-B A、MS+1 mg/L6-B A、1/2MS+2mg/L6-B A+0.05mg/L IB A、MS+2mg/L6-BA，丛生芽诱导率分别为60%、62.5%、81.25%、77.27%和47.5%。
2.5IBA浓度对丛生芽生根的影响
表1不同萌发培养基对丛生芽分化的影响
huij
基因型
assistant professor
培养
基
外植体总数
remember when(个)
出芽外植体数
(个)
丛生芽诱导
率(%) 292黄豆
A1103027.27
B1033937.86silent all the years
C1122421.43鄂8157
A1153328.70
B1234839.02
C1104944.54
湘春豆18号
A702738.57
B843744.05
C864754.65
湘春豆13号
A1076056.07
B1035957.28
C1147464.91
湘春豆15号
A842529.76
B1113531.53
C1094238.53注：培养基配方中A:1/2MS;B:1/2MS+1mg/L6-BA;C:1/2 MS+2mg/L6-BA。
表2不同诱导培养基对丛生芽分化的影响
基本onair是什么意思
培养基
6-BA
(mg/L)
IBA
(mg/L)
丛生芽诱导率(%)
292黄豆鄂8157
湘春豆
18号
湘春豆
13号
湘春豆
15号
1/2MS
1037.0428.7540.0031.5825.00
阿拉伯语
2044.4450.0045.6723.5325.00
3041.3852.5027.3038.1034.78
4031.0338.1024.4535.0042.50
1/2MS吝啬的意思
10.0540.0026.6748.1564.2928.57
20.0551.7233.3356.5577.2737.93
30.0521.4328.5744.0067.7440.00
40.0532.1427.2740.2854.5446.88 MS
1059.0928.3081.2544.4440.00
2060.0062.5035.2921.4347.50
3039.3043.7547.0658.8238.18
4056.0033.3353.5742.3143.75实验表明，当生根培养基中不添加IB A时，部分外植体能正常生根，生根率为65.38%。添加不同浓度IB A后，生根率明显升高。当IBA浓度为2mg/ L时，生根率达到92%。实验还显示，在根分化的启动时间方面，添加IBA可使生根时间显著缩短，从原来的6~7d缩短到4d，并且添加IBA的诱导出的根比不添加IBA的粗壮。
参考文献:
[1]Parrott W A,Williams E G,Hildebrand D P,et al.Effect of genotype
on s omatic embryogenesi s form immature cotyledons of soybean[J].
Plant Cell,tiss ue and Organ Cul ture,1989,16(1):15-211
[2]肖文言，王连铮.大豆原生质体培养经胚胎(下转第36页)
碱含量变化较大，其它几个主要烤烟品种在不同的年份里烟叶烟碱含量相对稳定；不同的品种烟叶烟
碱含量差异相对较小。云烟87变异最小，其次为云烟85。云烟87和云烟85烟叶烟碱含量在华南烟区的稳定性优于K326和CB-1。
表6华南烟区烤烟品种烟碱含量比较(%)
部位
K326
0304平均CV
云烟85
03CV
云烟87
03CV
CB-1
0304平均CV
上部叶 3.45 3.70 3.5712.66 3.8915.19 3.78 2.12 3.38 4.30 3.8418.45中部叶 2.82 2.84 2.8318.26 3.17 5.85 3.09 6.08 2.52 3.21 2.8720.64下部叶 2.11 2.06 2.0826.36 2.3821.57 2.4914.88 1.26 1.83 1.6719.43
2.3.5西南烟区烤烟品种烟碱含量比较2003、2004年西南烟区种植的主要品种有K326、云烟87、云烟85、红大、NC82。比较西南烟区几个主要烤烟品种烟叶烟碱含量，显示云烟87上、中部叶，红大各部位叶及NC82上部叶在不同的年份里烟叶烟碱含量变化较大，其它几个主要烤烟品种在不同的年份里烟叶烟碱含量相对稳定；不同的品种烟叶烟碱含量差异相对较小。NC82、云烟87变异较小,NC82、云烟87烟叶烟碱含量在华南烟区的稳定性优于K326、云烟85、红大。partner什么意思
表7西南烟区烤烟品种烟碱含量比较(%)
部位
K326
0304平均CV
云烟87
0304平均CV
云烟85
0304平均CV
红大
0304平均CV
NC82
0304平均CV(%)
上部叶 4.12 4.24 4.1619.59 4.06 3.56 3.8115.29 4.19 3.87 4.0622.58 4.47 3.17 3.8829.28 5.11 4.02 4.7419.93中部叶 3.19 3.19 3.1925.74 3.09 2.65 2.8523.46 3.35 3.08 3.2425.20 3.51 2.11 2.8728.42 3.47 3.19 3.3619.72下部叶 2.16 2.24 2.1927.21 2.09 1.88 1.9823.37 2.28 1.89 2.1229.13 3.40 2.10 2.2218.32 1.69 1.94 1.7720.81
对几个主要烟区不同烤烟品种烟叶烟碱含量的研究显示：华中、华南、西南烟区由烤烟品种引起的烟叶烟碱含量的差异较小，而东北、黄淮烟区由烤烟品种引起的烟叶烟碱含量差异较大。南方烟区烟叶烟碱含量较高，而种植的不同烤烟品种烟叶烟碱含量差异较小；北方烟区烟叶烟碱含量较低，而种植的不同烤烟品种烟叶烟碱含量差异较大，说明南方烟区烟叶烟碱含量的稳定性优于北方烟区。
有3个烤烟品种在多个烟区种植，分别为K326 (表4、5、6、7)、云烟87(表3、4、5、6、7)和云烟85(表4、5、6、7)。通过分析，可以看出同一品种在不同烟区烟碱含量差异很大，其中K326在不同烟区烟碱含量由高到低依次为华中烟区、西南烟区、华南烟区、黄淮烟区，云烟87依次为华南烟区、华中烟区、西南烟区、东北烟区、黄淮烟区，云烟85依次为华南烟区、西南烟区、华中烟区、黄淮烟区，其规律与不同烟区烟叶平均烟碱含量略有不同，但同一品种在不同烟区烟叶烟碱含量基本符合南方烟区高于北方烟区这一规律，说明种植烟区和烤烟品种均对烟叶烟碱含量产生影响。
参考文献:
michelangelo
[1]王瑞新，韩富根.烟草化学品质分析[M]1郑州：河南科学技术
炒鱿鱼的英文出版社,1992,77.
[2]刘绚霞，刘朝侠.影响烟叶烟碱含量的因素分析[J].甘肃农业
科技,1996,(7):39-40.
[3]烟叶生产与管理编写组.烟叶生产与管理[M].北京：中国科学
技术出版社,2002.
[4]闫克玉.烟草化学[M].郑州：郑州大学出版社,20021117-130.
[5]胡国松，郑伟，李智勇，等.烤烟营养原理[M].北京：科学技
术出版社,2000.
(上接第32页)
发生高频率再生植株[J].大豆科学,1993,(12):249-251. [3]邓向阳，卫志明.大豆转化技术[J].植物生理学通讯,1998,34
(5):381-387.
[4]周延清，李金亭，姬晓明，等.大豆离体快速繁殖研究[J].河南
师范大学学报,2002,30(2):120-122.
[5]Wright M S,Williams M H,Piers on R E.Ini ti ation and propagation of
Glyxine Max L.Merr.Plants from tissue-cultured epicotyls[J].Plant Cell Ti ssue Org Cult,1987,(8):83-90.[6]刘北东，朱延明，李海燕，等.大豆子叶节再生影响因素的研究
[J].大豆科学,2002,21(2):88-92.
[7]周思军，李希臣，刘昭军，等.通过农杆菌介导法将Bt(cryIA)基
因导入大豆[J].大豆科学,2001,20(3):157-162.
[8]袁鹰，刘德璞，郑培和，等.大豆组织培养再生植株研究[J].
大豆科学,2001,20(1):9-13.
[9]张淑珍，徐鹏飞，林世锋，等.高油高蛋白大豆子叶节丛生芽的
诱导[J].农业系统科学与综合研究,2004,20(3):238-230.
