2021(2): 46-53 SINO-OVERSEAS GRAPEVINE & WINE
葡萄酒微生物污染形成的不良风味
物质研究进展
姜文广，赵虎，吴训仑，牟玉柱，于政君，李记明*
scopolamine
（烟台张裕集团有限公司/山东省葡萄酒微生物发酵技术重点实验室，山东烟台 264001）
摘要：葡萄酒中不良风味物质的存在严重影响葡萄酒的品质，给生产带来较大的经济损失。对葡萄酒生产过程中由于微生物污染而形成的不良风味物质及主要预防措施进行主要介绍，包括葡萄原料被霉菌污染产生的蘑菇味和泥土味等物质；葡萄酒被酒香酵母污染产生的马厩味、酚味和鼠味等物质，被乳酸菌污染产生的黄油味、饭馊味和老鹳草味等物质，被醋酸菌污染产生的胶水味、煮苹果味和醋酸味等物质；橡木桶和软木塞被真菌污染产生的霉味、木塞味等物质。通过对微生物污染产生的不良风味物质特征及其主要防治措施进行系统梳理，为葡萄酒酿造生产提供借鉴。
关键词：葡萄酒；不良风味物质；微生物污染
中图分类号：TS262.61 文献标志码：A
DOI：10.13414/jki.zwpp.2021.02.011艾美奖获奖
Rearch advances of off-flavour compounds formed by
microbial contamination in wine producing
JIANG Wenguang, ZHAO Hu, WU Xunlun, MU Yuzhu, YU Zhengjun, LI Jiming*
(Yantai Changyu Group Co., Ltd./Shandong Provincial Key Laboratory of
vox
Wine Microbial Fermentation Technology, Yantai 264001, China)
Abstract: The existence of the off-flavor compounds in wine riously affects the quality of wine, and brings great economic loss to wine production. The off-flavor compounds from microbial pollution in wine making process and the main preventive measures were introduced, including mushrooms odor and earthy odor compounds from grape contaminated by mould; brettanomyces odor, phenol odor and mousy odor compounds from wine contaminated by brettanomyces; butter odor, sour rice odor, and geranium odor compounds from wine contaminated by lactic acid bacteria; glue odor, cooked apple odor, and vinegar odor compounds from wine contaminated by acetate bacteria; the musty or cork taste of oak barrels and corks caud by fungal contamination. In this paper, the chara
cteristics of the off-flavor substances produced by microbial contamination and the main prevention and control measures were systematically sorted out, so as to provide reference for wine production.
key words: wine; off-flavour compound; microbial contamination
收稿日期：2020-10-28
基金项目：山东省泰山产业领才工程专项经费资助（tscy20150212）
作者简介：姜文广，男，高级工程师，主要从事葡萄酒酿造工艺研究。E-mail: zyjiangwenguang＠
*通信作者：李记明，男，研究员，博士，主要从事葡萄与葡萄酒研究。E-mail: zyljm＠
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葡萄酒作为一种健康时尚的饮品，因其具有优雅怡人的香气和鲜艳诱人的颜色，受到了众多消费者的青睐，也逐步进入人们的日常生活中。葡萄酒香气是葡萄酒质量的一个重要评价指标，其含量、比例以及平衡关系等构成了不同特色和风格的葡萄酒[1]。
但是许多葡萄酒在发酵、陈酿、灌装及销售环节中都有可能会遇到微生物的污染，形成一些不良气味物质，使葡萄酒具有令人不悦的感觉[2]。目前已报道的葡萄酒中主要不良风味物质有几十种，它们的感官阈值相差很大，从200 mg/L的醋酸到3 ng/L的2,4,6-三氯苯甲醚，这些异味物质来源于葡萄原料、葡萄酒发酵、储存、装瓶等不同生产环节，严重降低葡萄酒的品质，给葡萄酒商带来较大经济损失。
近年国内有关葡萄酒化学成分研究较多，主要集中于香气、酚类等物质，有关葡萄酒中不良气味物质的研究正逐步引起关注，如葡萄酒中挥发酚、软木塞中TCA 等[2-4]。而关于葡萄酒风味物质的研究起步较晚，尚缺乏对葡萄酒中异味物质的全面认识。对葡萄酒酿造生产中由微生物污染产生的不良风味物质的风味特征和主要防治措施进行系统梳理，以期为我国葡萄酒酿造生产提供借鉴。
1 微生物污染形成的主要不良气味物质
目前葡萄酒生产过程中已知的由微生物污染形成的主要不良气味物质主要有22种（表1）。其中，葡萄原料受到污染而产生的主要有6种，使葡萄酒呈现蘑菇或泥土味等；葡萄酒贮存中受到酒香酵母污染而产生的主要有5种，使葡萄酒具有马厩味、酚味、烘烤味或饼干味等；葡萄酒发酵或贮存中受乳酸菌污染而产生的主要有6种，使葡萄酒呈现黄油味、饼干味或天竺葵气味等；葡萄酒贮存中受醋酸菌污染而产生的主要有3种，使葡萄酒呈现醋酸味、煮水果味或胶水味等；另外，因橡木桶或木塞被真菌污染而产生的主要有4种，使葡萄酒呈现木塞味、湿抹布味或霉味等。
表1 葡萄酒中微生物污染形成的主要不良气味物质
被真菌污染的葡萄1-辛烯-3-酮 1-Octen-3-one蘑菇70 ng/L[5]被真菌污染的葡萄2-甲基异莰醇 2-Methylisoborneol泥土55 ng/L[6]被真菌污染的葡萄土臭味素 (±)-Geosmin泥土50 ng/L[7]被真菌污染的葡萄
葑酮 (+)-Fenchone泥土500 µg/L（水）[6]被真菌污染的葡萄
葑醇 (+)-Fenchol泥土50 µg/L（水）[6]被真菌污染的葡萄4-乙基苯酚 4-Ethylphenol马厩味430 µg/L[8]酒香酵母属/德克酵母属
4-乙基愈创木酚 4-Ethylguaiacol酚味33 µg/L[8]酒香酵母属/德克酵母属
4-乙基苯邻二酚 4-Ethylcatechol酚味50 µg/L[8]酒香酵母属/德克酵母属2-乙基四氢吡啶 2-Ethyltetrahydropyridine烘烤味、饼干味150 µg/L[9]酒香酵母属/德克酵母属乳酸菌2-乙酰基四氢吡啶 2-Acetyltetrahydopyridine烘烤味、饼干味 1.6 µg/L（水）[9]酒香酵母属/德克酵母属乳酸菌2-乙酰基吡咯 2-Acetylpyrroline烘烤味、饼干味100 ng/L（水）[10]乳酸菌
2,3-丁二酮 2,3-Butanedione(diacetyl)黄油味0.1～2.0 mg/L[11]乳酸菌
乙偶姻 3-hydroxy-2-butanone(acetoin)黄油味150 mg/[11]乳酸菌2-甲氧基-3, 5-己二烯 2-Ethoxy-3,5-hexadiene天竺葵气味0.1 mg/L[11]乳酸菌
2,4,6-三氯苯甲醚 2,4,6-Trichloroanisole (TCA)木塞味 3 ng/L[12]被真菌污染的橡木桶或木塞2,3,4,6-四氯苯甲醚 2,3,4,6-Tetrachloroanisole (TeCA)霉味15 ng/L[13]被真菌污染的橡木桶或木塞2,4,6-三溴苯甲醚 2,4,6-Tribromoanisole (TBA)霉味 3 ng/L[14]被真菌污染的橡木桶或木塞五氯苯甲醚 Pentachloroanisole (PCA)尘土10 µg/L[13]被真菌污染的橡木桶或木塞乙酸乙酯 Ethyl acetate煮水果味120 mg/L[11]醋菌属菌种
乙醛 Acetaldehyde青苹果味100 mg/L[11]醋菌属菌种
乙酸 Acetic acid醋酸味200 mg/L[11]醋菌属菌种
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2021年6月英语四六级成绩查询时间2 葡萄原料污染带来的不良气味物质
葡萄腐烂是造成葡萄酒品质降低的重要因素，如酚类物质被多酚氧化酶破坏（漆酶）、香气物质如单体萜烯类被转化为无香气物质、脂肪酸酯类物质被酯酶水解等[15-17]。
葡萄腐烂主要是由灰霉菌（Botrytis cinereas）引起，被污染的葡萄汁（葡萄酒）中具有蘑菇味、霉味、樟脑味、泥土味等感官缺陷，特别是在葡萄收获期，遇降雨或冰雹灾害等会加剧这些感官缺陷的出现[18-19]。
目前造成葡萄汁或葡萄酒中这种缺陷的物质已被证实，主要有1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、2-甲基异莰醇、土臭味素、葑酮、葑醇、2-辛烯-1-醇和2-庚醇等[18,20]。2.1 蘑菇味物质
simimi1-辛烯-3-醇和1-辛烯-3-酮具有典型蘑菇气味，在葡萄酒中感官阈值较低，分别为40 µg/L和70 ng/L[5]。其中1-辛烯-3-醇可从葡萄汁迁移到葡萄酒中，是葡萄酒的蘑菇味香气缺陷的主要来源。1-辛烯-3-酮在酒精发酵过程中往往会消失，对葡萄酒蘑菇气味贡献很小，但有时在‘赤霞珠’‘蛇龙珠’和‘黑比诺’等葡萄酒会检测出来[18]。经研究证实，1-辛烯-3-醇和1-辛烯-3-酮主要是由灰霉菌生成[19]。此外，其他一些曲霉和青霉真菌如黑曲霉（Aspergillus ction Nigri）、短密青霉菌（Penicillium brevicompactum）、托姆青霉（Penicillium thomii）等也能够生成1-辛烯-3-醇和1-辛烯-3-酮[18,20-23]。
2.2 土腥味物质
土臭味素、2-甲基异莰醇、葑酮和葑醇是葡萄汁和葡萄酒中泥土味、霉味和樟脑味等不良气味的主要来源，这些气味统称土腥味。
在葡萄和葡萄酒中，土臭味素（二甲萘烷醇）被证实具有很强的泥土味，在含有部分腐烂葡萄的葡萄汁或葡萄酒中的含量均高于感官阈值。La Guerche等研究证实，在灰霉菌感染的葡萄中土臭味素来源于扩展青霉（Penicillium expansum）的代谢[24]。同时，Mattheis等认为米奇恩斯基青霉菌（Penicillium miczynskii）、嗜松青霉（Penicillium pinophilum）和肉青霉菌（Penicillium carneum）均具有生成土臭味素的能力[25]。
2-甲基异莰醇具有樟脑气味，其在葡萄酒中感官阈值很低，与土臭味素接近。这种化合物在腐烂的葡萄或葡萄汁中经常被检测出来，但在酒精发酵过程中会消失，在葡萄酒中很难检测出来，因此对葡萄酒香气基本无影响。另外，在被软木塞污染的葡萄酒中有时也可检测出来。2-甲基异莰醇是灰霉菌的一种代谢产物，同时一些青霉菌种和链霉菌种也发现具有生成该化合物的能力[22,26]。
crew葑酮和葑醇均具有泥土味，由于两者的感官阈值均较高，分别为500 µg/L和50 µg/L，所以只有高浓度才能在葡萄汁或葡萄酒中感觉出来[27]。
春节的英文
因此，为避免葡萄酒中带有上述不良气味，应确保葡萄原料新鲜、健康、无病虫害发生；在葡萄采收时注意避开阴雨天或清晨有露水时；葡萄采摘应选择葡萄果实自身温度较低时间，如在凌晨至上午；葡萄采摘后可洒干冰降温或入冷库低温存放等；葡萄运输到酒厂过程中避免挤压破碎，尽可能做到采摘后几小时内除梗破碎入罐等。直辖市英语
3 葡萄酒受酒香酵母污染生成的不良气味物质
酒香酵母属是一类在葡萄皮、葡萄酒以及发酵桶罐中普遍存在的酵母，它对葡萄酒的香气具有一定贡献，生成的糖苷酶可将葡萄汁或葡萄酒中不挥发的结合态糖苷键形式的风味前体化合物分解为游离态挥发的香气物质，从而增加酒的香气[28]。但是酒香酵母常被认为是降低葡萄酒感官品质的一种微生物，其产生的代谢产物对葡萄酒的色泽、风味、口感等方面有不利影响。如在葡萄酒酿造中，酒香酵母属的代谢产物不只是这些香气成分，同时也产生以4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚为典型代表的一类不良气味（马厩味、酚味等）[27-30]。另外，酒香酵母属均具有生成2-乙基四氢吡啶和2-乙酰基四氢吡啶两种具有“老鼠”异味（Mousy）化合物的能力，带来令人不愉快感觉[31-32]。
酒香酵母对环境有着较强的耐受能力，使酒厂对酒香酵母的防控难度加大。生产车间的墙面、地面、储酒容器、橡木桶及酿造设备等，均有可能感染酒香酵母。目前在葡萄酒的研究中发现诸多酒香酵母属的种类，包括：Brettanomyces custersianus、B. naardenensis、B. nanus、B. anomalus、B. brux
ellensi，B. intermediu等。还有，Walt提出一种具有产子囊孢子的酒香酵母属，被称为德克酵母属（Dekkera）[2]。
从葡萄园到葡萄酒灌装各环节都易受到酒香酵母属的污染。一是葡萄园管理不到位，葡萄果实受到酒香酵
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母属的侵袭；二是在葡萄酒酿造过程中，使用已经被酒香酵母属污染的酒罐或设备，葡萄酒很容易被污染；三是酸度较低、pH高、多酚含量高的葡萄酒易受酒香酵母菌属侵染，还有多年老橡木桶同样是其生长繁殖的良好环境[33]。
因此，葡萄酒生产过程中需提高预防酒香酵母污染的意识，在确保贮酒容器及设备清洁卫生的情况下，及时调整葡萄酒的pH等指标，将葡萄酒中游离SO2的含量保持在30～40 mg/L，有利于酒香酵母的防控。同时，加强对葡萄酒贮存过程感官质量的监测。一旦发现存在酒香酵母污染问题，及时进行下胶过滤处理，去除酒香酵母，提升香气洁净度。另外，添加抑酒香酵母多糖，如Stab Micro（一种从黑曲霉中提取出的天然多糖）可以特异性地结合酵母的细胞壁，从而起到抑制酒香酵母的作用[34]。
3.1 马厩味和药味物质
4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚是存在于红葡萄酒中的一类挥发性酚类物质。4-乙基苯酚通常被描述为草棚味、马厩味，4-乙基愈创木酚则被描述为三叶草味、药剂味，因它们的阈值较低（4-乙基苯酚430 μg/L、4-乙基愈创木酚33 μg/L）[8]，当酒香酵母产生的化学物质较少时，能增加葡萄酒的复杂度，带来人们常说的雪松、泥土或者蘑菇的香气，有些情况下，还会用动物野味来形容这种气息。而当酒香酵母产生化学物质含量过高时，这些味道则会变成谷仓、牲畜棚、湿羊毛、湿狗等味道。
4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚的产生主要是因为酒香酵母使葡萄中的羟基苯丙烯酸脱羧生成4-乙烯基苯酚和4-乙烯基愈创木酚，随后进一步被还原成4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚。
有关酒香酵母生物合成乙基酚的研究表明，有两种酶在先后起主要作用。第一种酶是肉桂酸脱羧酶，将肉桂酸转化为乙烯基酚；第二种是乙烯基酚还原酶。肉桂酸脱羧酶也存在于发酵使用的果胶酶中，目前果胶酶生产商中已意识到这一点，纷纷推出不含有肉桂酰基酯酶的果胶酶产品[35]。
3.2 鼠味物质
在葡萄酒中经常会出现类似老鼠的异味，这种异味通常在葡萄酒咽下或吐出后，在口腔上颚会感觉出来，一旦感觉到这种气味会持续超过10 min。但这种异味不能通过嗅闻感觉到，因为在葡萄酒的pH环
境下这种异味不是完全挥发性的。在葡萄酒中出现老鼠味被认为最不能接受，目前尚无消除办法[36]。
据研究证实，2-乙基四氢吡啶、2-乙酰基四氢吡啶和2-乙酰基吡咯是3种已知可产生老鼠异味的化合物[31-32]。在葡萄酒中，德克酵母属/酒香酵母属酵母已证实具有生成至少其中两种物质的能力，而乳酸菌具有产生全部3种物质的能力。关于老鼠异味存在于部分葡萄酒中的原因现在还没完全弄清楚，目前为止已被确定可能与这种异味形成有关的物质，如赖氨酸、鸟氨酸、金属离子、溶氧等。德克酵母属/酒香酵母属酵母生成老鼠异味物质过程中，氧气可能起到关键作用，因为除酿造过程接触氧气外，在少量氧气条件下被德克酵母属/酒香酵母属酵母污染的葡萄酒不产生老鼠异味。
由于老鼠异味使人不愉快，检测时不必品尝葡萄酒。检测方法主要有两种[32]，一种是将酒滴到手背上摩擦，然后贴近皮肤嗅闻；第二种是在葡萄酒中滴加NaOH 等碱性试剂，然后嗅闻。两种方法都可以快速而有效的检测出葡萄酒中的鼠味味。另外，通过氧化也可以检测这种异味，即将葡萄酒暴露到空气或氧气中一段时间，然后嗅闻。
2-乙基四氢吡啶、2-乙酰基四氢吡啶各自纯标准品均具有烘烤气味或饼干气味。2-乙基四氢吡啶在葡萄酒中感官阈值为150 µg/L[8]，目前在葡萄酒中的含量均低于阈值，不是葡萄酒中老鼠异味的主要来源，因此关于2-乙基四氢吡啶的研究很少。但是已证实某些乳酸菌可生成162 µg/L 2-乙基四氢吡啶，使其成为一种潜在的老鼠异味贡献物质[37]。
2-乙酰基四氢吡啶是一种氧化不稳定化合物，在水中的感官阈值为2-乙基四氢吡啶的1%，约为1.6 µg/L[9]，而在葡萄酒中浓度为4.8～106 µg/L。2-乙酰基四氢吡啶具有两种结构，即2-乙酰基-3,4,5,6-四氢吡啶和2-乙酰基-1,4,5,6-四氢吡啶。两种异构体存在形式可能由pH决定，在葡萄酒酸性环境中以氨基态形式存在，而亚氨态形式具有老鼠异味。在葡萄酒中，较低pH环境有利于极性氨基形式，而口腔唾液中含有碳酸氢钠，较温和的环境，2-乙酰基四氢吡啶会发生形式转变，形成易挥发的亚氨态形式。这也可解释为什么葡萄酒的鼠味嗅闻不出来，而在品尝后能感觉出来。同样将酒滴到手背上摩擦，然后贴近皮肤嗅闻或用碱液鉴定，也能证实这一
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点，因为与葡萄酒相比较，皮肤弱酸性，引起pH的改变；同样，碱性溶液方法，也是通过氢氧化钠溶液引起葡萄酒的快速碱化，使鼠味物质挥发出来。
因此，减少不良风味物质的产生，需控制发酵过程中酒香酵母生长繁殖的必要条件。例如，做好对设备、原材料的清洗和杀菌工作；不用已经被污染的酒桶；使用适量的SO2；酒桶满罐装酒；接种优质酵母菌菌种，从而减少
B.bruxellensis生长繁殖的可能性等[38]。
4 葡萄酒乳酸菌污染生成的不良气味物质
4.1 黄油味、馊饭味物质
2,3-丁二酮（双乙酰）是葡萄酒中的一种风味物质。在葡萄酒中之所以能够闻到、尝到黄油的香味，主要取决于葡萄酒中双乙酰含量，这种化学物质可以通过苹-乳发酵得到。在这个过程中，发生转变的是葡萄酒中口感尖酸的苹果酸，产物是口感更柔顺、带有奶油香气的乳酸（这种物质也存在于牛奶中）。苹-乳发酵可以降低葡萄酒的酸度，丰富葡萄酒风味物质，同时还可以释放一些二氧化碳气体。另外，葡萄酒在橡木桶中的发酵过程也能够使葡萄酒里有黄油的香味。大多数葡萄酒会在橡木桶中陈酿，随着时间的推移，葡萄酒的口感将变得更加柔和，更加复杂。当葡萄酒中双乙酰含量为4 mg/L 以下时，可增加葡萄酒的口感及风味复杂性，带来黄油（Butter）或奶酪（Chee）香气；当含量高于4 mg/L 时，就可能产生令人生厌的馊饭味（Sour rice），葡萄酒表现变质迹象[39]。由于双乙酰稳定性较差，能被还原为乙偶姻和2,3-丁二醇，两者在葡萄酒中的感官阈值很高，分别为150 mg/L和600 mg/L，因此对葡萄酒的风味影响不大[40]。
影响葡萄酒苹-乳发酵过程中双乙酰生成的因素较多，如接种的乳酸菌菌株、氧含量、发酵温度和发酵时间等。要想获得双乙酰含量较低的葡萄酒，在酒精发酵后期，接种低产双乙酰的乳酸菌株系，密切
关注苹-乳发酵进度，当发酵接收后，立即分离满灌，调整游离SO2到30～45 mg/L[41]。
4.2 老鹳草物质
山梨酸（2,4-己二烯酸）可作为化学防腐剂用于甜葡萄酒的装瓶，与SO2协同使用防止葡萄酒在酵母存在时进行再发酵。但是，它对细菌没有作用。而且，它可以被乳酸菌所分解，产生一种很不愉快的气味让人想起压碎的老鹳草叶子（Geranium leaf）。葡萄酒中有乳酸菌时似乎都能引起这种反应。因此，添加山梨酸的葡萄酒装瓶时要加倍小心，以确保菌群已被消除[11]。
山梨酸被乳酸菌分解首先产生的是2,4-己二烯-1-醇（2,4-hexadiene-1-ol），其乙醛形式很可能是中间产物，但没有被证实。添加这种醇，与乳酸或者乙酸混合到葡萄酒中产生典型的不愉快气味。而且，感官阈值下降到初始值的1/50，甚至1/100。现在已经知道乙醇引起山梨酸分解产物化学结构的调整。首先，在酸性介质中这些分子的重排引起双键的移动和醇的作用，产生3,5-己二烯-2-醇。醚的氧化物在乙醇存在时产生，导致2-甲氧基-3,5-己二烯的生成。这种极其有味的分子也许与其他分子一起在老鹳草气味中起着重要作用。中秋的习俗
5 橡木桶或木塞受真菌污染的不良气味物质
葡萄酒中软木塞味是葡萄酒生产中一种重要的异味物质，通常感官描述为湿抹布味、湿霉味、泥土味
等不良气味，这主要是由于酒中含有2,4,6-三氯苯甲醚、2,3,4,6-四氯苯甲醚、五氯苯甲醚等被称作氯代茴香醚类化合物，这些化合物是橡木桶或软木塞中的甲基化氯酚物质受真菌（青霉、木霉等）感染生成的。这些氯酚化合物，一方面来源于橡木生长期间的农药和木材防腐剂，另一方面是消毒期间使用氯基制剂使其中的酚类物质氯化[42]。在过去，酒厂常用氯水来进行木桶消毒或用含氯的自来水进行木桶清洗，这就为TCA（2,4,6-三氯苯甲醚）的产生提供了条件。如今酒厂已经意识到这一点，如改用除氯软化水清洗橡木桶等，但是只要酒窖曾经产生过TCA污染就很难完全去除。
TCA是葡萄酒中软木塞味的主要来源，它在葡萄酒中感官阈值只有3 ng/L，痕量的TCA就可以对葡萄酒的风味和品质造成不可逆的破坏，导致大部分的消费者排斥[12]。据估计，全球2%～5%的瓶装酒因瓶塞受到TCA污染，每年造成的损失估计为十多亿美元[43]。此外，TCA 的一些降解产物如2,6-二氯苯甲醚和溴化产物如2,4,6-三溴苯甲醚也具有软木塞异味。
除TCA外，2,3,4,6-四氯苯甲醚、五氯苯甲醚两种氯代茴香醚类化合物也可在软木塞味葡萄酒中检测出来，
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