2021(3): 8-17 SINO-OVERSEAS GRAPEVINE & WINE
无核玫瑰香味葡萄种质创新及
胚挽救技术优化
sweet是什么意思陈烁1，李莎莎1，骆强伟2，徐炎1*，王跃进1*
四级分数
（1. 西北农林科技大学园艺学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室/农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，陕西杨陵 712100；2. 新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所，新疆鄯善 838200）摘要：萜类物质是调控葡萄果实香味的主要物质。研究以‘玫瑰香’等8个鲜食葡萄成熟果实为试材，检测
萜类物质合成途径关键酶基因在不同葡萄中的表达情况，并以此类基因高表达的玫瑰香味葡萄作父本，通过
离体胚挽救创新无核香味葡萄种质资源。针对采样时间与培养基成分，对胚挽救技术进行优化。利用分子标
uruguay记技术对双亲鉴定，对F1代无核性状进行早期辅助选择。结果表明：萜类物质合成关键酶基因在‘玫瑰香’
和‘183’中表达高于其他品种；‘京早晶’及‘Fresno Seedless’做母本时最佳采样时间分别为授粉后42 d
和36 d；幼胚离体培养以WPM＋0.1 mg/L BR＋0.2 mg/L 6-BA作胚萌发培养基，胚萌发率较高。通过无核分子
标记鉴定出56个株系具有特异性条带，其中14个株系均能在两种不同无核标记下扩增出特异性条带。
关键词：葡萄；无核性状；萜类物质合成基因表达；香味；胚挽救育种；分子标记辅助选择
中图分类号：S663.1 文献标志码：A
DOI：10.13414/jki.zwpp.2021.03.002
Production of potential edless grape germplasm with ro aroma and
optimization of embryo rescue technique
CHEN Shuo1, LI Shasha1, LUO Qiangwei2, XU Yan1*, WANG Yuejin1*
(1. College of Horticulture, Northwest Agriculture and Forestry University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas/ Ministry of Agriculture Key Laboratory of Horticultural Plant Biolog
y and Germplasm Innovation in Northwest, Yangling 712100, China;
2. Institute of Grapes and Melons on the Rearch in Xinjiang, Shanshan 838200, China)
Abstract: Terpenoids are the main substances that regulate the aroma of grape berries. Using the ripe fruits of
eight table grapes including 'Muscat Hamburg' as the materials. Detected the expression of key enzyme genes in
terpenoid synthesis pathway in grape berries with different flavors. Ro aroma grapes with high expression levels
of key genes in the terpenes biosynthesis pathway were ud as the male parent. Using embryo rescue technology to
created a new edless grape with rosy aroma. According to the sampling time and medium composition, the embryo
rescue technology was optimized. Molecular markers were ud for early lection of edless traits in F1 hybrids.
The results showed that genes of key enzymes involved in terpenoid biosynthesis were highly expresd in 'Muscat
Hamburg' and '183'. It was determined that the best sampling times for hybrid combinations with 'Jingzaojing' and
'Fresno Seedless' as the female parent were 42 days and 36 days after pollination. An optimized embryo germination
medium: WPM＋0.1 mg/L BR＋0.2 mg/L 6-BA. A total of 56 strains were identified by edless molecular markers,
and 14 strains were able to amplify specific bands in two different markers.
Key words: grapevine; edlessness; terpenoids synthesis gene expression; aroma; embryo rescue; marker-assisted lection
收稿日期：2021-03-19
基金项目：财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系资助（CARS-29-yc-3）
作者简介：陈烁（1994—），新疆伊宁，硕士，从事葡萄胚挽救育种研究。E-mail:****************
directly
*通信作者：徐炎（1972—），教授，从事葡萄种质资源与育种。E-mail:*****************
王跃进（1958—），博士，教授，从事葡萄抗病育种研究。E-mail:*****************
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葡萄的质量和营养成分以及无核葡萄新品种的育种一直是重要的研究课题[1-2]。无核葡萄因其滋味甜美、即采即食等原因成为消费者选择鲜食水果和果脯的首选。香味是影响果实品质的重要因素。目前，能在市场上被广泛推广和栽培的无核且具有香味的葡萄品种还非常有限，因此将无核和香味两个性状叠加于一体的新品种是葡萄育种研究中的重要目标。玫瑰香味是葡萄品种独特的气味，该香气与萜类化合物质的存在有关，尤其是由于芳樟醇、香叶醇、橙花醇、香茅醇和a-萜品醇等萜类化合物的成分在香味葡萄中浓度较高，是调控香味的主要物质[3-4]。在植物中已鉴定出两种独立的萜类化合物合成途径：萜胞质的甲羟戊酸途径（Mevalonate pathway, MV A）和质体的2-甲基D-赤藓糖醇-4-磷酸途径（Methyl-erythritol-4-phosphathway, MEP），而MEP途径被认为是葡萄果肉中单萜底物生物合成的主要途径[5]。MEP合成途径前期的关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）、1-脱氧-D-木酮
糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）和4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶（HDR）共同作用生成所有萜类化合物的前体，异戊烯基二磷酸（Isopentenyl pyrophosphate, IPP）及其异构体二磷酸二甲基烯丙酯（Imethylallul pyrophosphate, DMAPP）[6]。在合成途径中期，IPP和DMAPP通过异戊二烯基转移酶、香叶基磷酸二氢酯合酶（gernayl diphosphate syntha, GPPS）的作用缩合，生成香叶基磷酸二氢酯（gernayl diphosphate, GPP），不同单萜合酶在晚期催化GPP转化为环状和非环状单萜[7]。对葡萄基因组测序预测到一些与萜类合成相关的酶基因[8-9]，其中合成里那醇、香叶醇和a-萜品醇等萜类物质的酶基因功能已被验证。
果树胚挽救的初次成功是在樱桃中进行离体胚培养[10]，随后胚挽救技术得到发展。Ramming通过离体胚培养成功培育了无核葡萄植株[11]。为了适应生产要求和育种需求的增加，胚挽救技术也在不断完善。影响该技术的因素主要有：亲本基因型、取样时间、培养基成分等[12]。前人对影响胚珠发育的培养条件进行了研究，成功获得胚挽救杂交苗[13-14]。王跃进等[15]利用无核葡萄胚挽救技术培育‘无核×中国野生葡萄’的胚珠，并研究了采样时间、不同培养基及添加激素、接种方式对胚珠发育的影响。潘学军[16]获得了幼胚发育的最佳培养基为MM3＋10 mmol/L甘氨酸。田莉莉[17]认为，可胚挽救的母本材料对杂种胚的萌发和成苗影响较大，‘底来特’（Delight）、‘爱莫无核’（Olmo Seedless）、‘红宝石无核’等无核品种适合在杂交中作母本，成苗率相对较低的‘无核紫’‘无核白’‘杨格尔’（Youngle）等品种不宜作母本。唐冬梅[18]通过对比取材时间认为，在一定范围内，较晚取材接种
mars是什么意思的胚珠成苗率较高，且通过喷施植物生长调节剂可以促进胚珠发育。贾姗姗[19]在胚萌发培养基WPM中添加激动素（KT）和玉米素（ZT），促进了无核香味杂种胚幼苗根的生长。
通过研究不同香味葡萄品种果实成熟期控制香味物质的萜类合成关键酶基因的表达，筛选出具有萜类物质合成酶基因高表达的香味品种作父本，以种子败育型葡萄作母本，利用胚挽救育种技术培育无核玫瑰香味优质品种，为无核香味葡萄育种奠定材料基础。通过比较亲本基因型对胚挽救技术的影响，筛选与优化胚萌发培养基及确定不同母本最适采样时间，提高无核玫瑰香味葡萄胚挽救效率。利用分子标记技术对杂种F1代的无核性状进行早期辅助选择，以提高杂种后代无核选育效率。
1 材料与方法
1.1 试材及取样
随着时间的流逝试验于2019年5月—2020年6月在新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所（吐鲁番市鄯善县，北纬42.91°，东经90.30°）、西北农林科技大学葡萄种质资源圃及旱区作物逆境生物学国家重点实验室完成。
用于萜类物质合成关键酶基因实时定量PCR的葡萄品种有：浓香型品种‘莎巴珍珠’‘阳光玫瑰’‘玫瑰香’‘183’，淡香型品种‘巨玫瑰’‘早玫瑰’‘意大利’及无香型品种‘无核白’等，均定植于西北农林科技大学葡萄种质资源圃中。
用于胚挽救杂交的试材中，母本为9个种子败育型无核葡萄品种：‘爱神玫瑰’‘昆香无核’‘京早晶’‘火焰无核’‘美丽无核’‘莫丽莎无核’‘红宝石无核’‘Fresno Seedless’‘Australian Seedless’，父本为5个玫瑰香味品种‘玫瑰香’‘阳光玫瑰’‘巨玫瑰’‘183’‘贵妃玫瑰’。以上杂交试验于新疆维葡萄瓜果研究所进行，供试葡萄品种均采用水平棚架栽培，株距1 m，行距5 m。胚挽救杂交组合配置见表1。
1.2 萜类物质合成关键酶基因表达分析
以‘莎巴珍珠’等8个葡萄品种为试材，根据不同品种成熟情况，2019年7月下旬至9月上旬采集各品种成熟
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果实。称取采集的成熟果实300 g ，剥取果皮0.5～1 g 置于2.0 mL 无酶离心管后标号并迅速放入液氮中速冻，后放入超低温冰箱备用。全程在冰上操作，防止RNA 降解，其中果皮剥离时尽可能不粘连果
肉。使用RNAperp Pure 多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒（天根）提取RNA ，参照cDNA 第一链合成预混试剂盒（Cofitt ）使用说明逆转录成cDNA ，置于超低温冰箱备用。以cDNA 为模板，根据萜类物质合成通路中各阶段关键酶基因序列，利用软件Primer 6设计引物（表2）并进行实时定量PCR 检测。引物参照Martin [8]的方法，使用VvActin 和
VvGAPDH 2个看家基因作为内参。实时定量PCR 进行3次生物学重复，其数据分析利用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行单因素方差分析，显著性分析用Duncan's 检验（P ＜0.05）。
明尼苏达大学研究生1.3 胚挽救流程
采集并研磨花粉，密封保存并放于4 ℃冰箱备用。选择长势强壮的葡萄植株，采集粗壮结果母枝上发育良好的花序，用指尖轻轻掐去花冠顶盖部，使花药脱落，露出柱头，避免伤害柱头。去雄完成后，清理花穗上残余花粉并套袋标记。去雄2～3 d 后，开始授粉，且有黏液时授粉最好。授粉时间以晴天上午8:00—10:00最佳，授粉结束应立即套袋。连续授粉3～4 d 。不同杂交组合以最后一次授粉时间为准，在最适采样期将整穗果实采回实验室。从果柄处将果粒分别剪下，装入网兜内置于流水下冲洗3～4 h 。在无菌条件下，将消毒干净的果粒在玻璃培养皿中剥取胚珠，将剥离的胚珠接种在MM3固体胚发育培养基中培养。暗培养8～10周后，无菌条件下利用解剖镜剥取杂种胚，将胚平铺在WPM 胚萌发培养基中光照培养，温度为25±2 ℃。1个月后统计胚萌发数，2个月后统计成苗数，进行数据统计，胚挽救具体程序参照本课题组
表1 无核香味胚挽救杂交组合配置Table1 Configuration of hybrid combinations
杂交组合Cross combinations 母本性状Female characteristics 父本性状
Male characteristics 爱神玫瑰×巨玫瑰Aishen Meigui ×Jumeigui 无核、玫瑰香味有核、玫瑰香味爱神玫瑰×183Aishen Meigui ×183无核、玫瑰香味有核、玫瑰香味昆香无核×贵妃玫瑰continue的意思
Kunxiang Seedless ×Guifei Meigui 无核、玫瑰香味有核、玫瑰香味昆香无核×玫瑰香
Kunxiang Seedless ×Muscat Hamburg
无核、玫瑰香味
有核、玫瑰香味京早晶无核×玫瑰香Jingzaojing ×Muscat Hamburg 无核有核、玫瑰香味火焰无核×玫瑰香
Flame Seedless ×Muscat Hamburg 无核有核、玫瑰香味美丽无核×阳光玫瑰Beauty Seedless ×Shine Muscat 无核有核、玫瑰香味莫丽莎无核×阳光玫瑰Melissa Seedless ×Shine Muscat 无核有核、玫瑰香味红宝石无核×阳光玫瑰Ruby Seedless ×Shine Muscat 无核有核、玫瑰香味Fresno Seedless ×玫瑰香Fresno Seedless ×Muscat Hamburg 无核有核、玫瑰香味Australian Seedless ×玫瑰香Australian Seedless ×Muscat Hamburg
无核
有核、玫瑰香味
表2 试验所需引物序列
Table 2 Primers ud in the experiment
基因类型Gene type
基因名称Gene name
引物序列
Primer quence (5'-3')
萜类代谢前期基因Gene in the early pathway
DXS1F: CTCATTTCCTGCCCATTTTAGC R: CTTACTCCTTTGCTGGGATTGG DXS3F: GAAGGCTCTGTTGGAGGGTTT R: TCCTCTGGTGATGCCTGTTCT DXR F: AGAGGCTTTGGCTGACTGTGA R: AACCTGCGCAACCTACTATTCC HDR
变形金刚 英文F: TCTTCCTCGTCTGTGGCTGTT R: GCGATTCATGAGCTCCAGAGT 萜类代谢中期基因Gene in the middle
pathway
GPPS F: AGAATCTGGGATTGGCATTCC R: TGGCGGATGTCAGACAATGA FPPS F: ATTGCTTATGGCAGGCGAAA R: CCGTTCCGATCTTACCAATCAC 萜类代谢后期基因Gene in the late pathway
Linnalool syn F: TGGGATTCTCTCCTGCCTTTT R: GCAGTAGGCACAAGCACAACA α-Terpineol syn
F: TGAAGGGAATGCTCTGCTTGT R: TGlTTTGCTCAAGGCCCTTT 内参基因Reference gene
Actin F: CTATCCTTCGTCTTGACCTTGCTG R: AGTGGTGAACATGTAACCCCTCTC GAPDH
F: TTCTCGTTGAGGGCTATTCCA R: CCACAGACTTCATCGGTGACA
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前期研究方法[18,27-28]。胚发育率（%）＝发育胚数/接种胚珠数×100，成苗率（%）＝成苗数/接种胚数×100。1.4 不同母本最佳采样时间的确定
对‘京早晶’和‘Fresno Seedless’为母本的无核香味胚挽救杂交组合进行连续取样，采样时间为授粉后36～44 d，取样间隔一天。将采下的果穗做好取样时间及组合名称标记并放在冰盒中保存，带到实验室于4 ℃冰箱备用。按照胚挽救流程统计数据并计算不同取样时间下各组合的胚发育率和成苗率。
1.5 胚萌发培养基最适芸苔素内酯浓度筛选
试验共设置了26种不同的胚萌发培养基，以WPM为基础培养基（WPM 2.41 g/L＋蔗糖20 g/L＋琼脂7 g/L＋活性炭1.5 g/L），分别添加不同浓度梯度的芸苔素内酯（brassinolide, BR）作胚萌发培养基并进行优化。比较不同培养基中胚的萌发率，筛选最适胚萌发的BR添加浓度，统计胚萌发率。
1.6 分子标记辅助选择无核葡萄胚挽救杂交子代
杂交亲本及子代基因组D N A的提取，无核探针GSLP1-569及无核标记SCF27-2000的引物序列及反应程序参考李志瑛[24]的方法。
2 结果与分析
2.1 果实中单萜类物质生物合成相关基因表达水平
对8个葡萄品种成熟果实中萜类物质合成关键酶基因进行实时荧光定量PCR检测（图1），其中7个为玫瑰香味品种，1个无香味品种作为对照。定量结果显示，调控萜类物质合成途径前期的关键酶基因DXS1、DXS3、DXR及HDR均在浓香型品种中表达量最高。其中，DXS1及DXS3在‘阳光玫瑰’中表达量最高，DXS1在‘阳光玫瑰’中的表达量是其它品种的3～5倍；DXS3除在‘阳光玫瑰’中高表达外，在‘玫瑰香’中也有较高表达；DXR在‘183’中表达量最高，而在淡香型‘意大利’中和无香型‘无核白’中表达量较低；HDR 在‘莎巴珍珠’及‘玫瑰香’成熟果实中表达量都较高。调控萜类物质合成途径中期的关键酶基因GPPS及FPPS在不同品种中表达呈现差异，GPPS在‘183’‘玫瑰香’‘阳光玫瑰’等浓香型品种中都有较高表达，而在‘意大利’中的表达量最低；FPPS在‘阳光玫瑰’及‘早玫瑰’中表达量最高，在‘阳光玫瑰’的表达量是其它品种的1～2.5倍，但其在部分浓香品种如‘玫瑰香’与‘莎巴珍珠’果实中的表达量并不高。调控萜类物质合成途径晚期的关键酶基因Linnalool syn和α-Terpineol syn在不同品种间的表达差异较大，Linnalool syn在‘阳光玫瑰’中的表达量最高，在‘早玫瑰’中的表达量次之；α-Terpineol syn在‘183’中的表达量显著高于其它品种。α-Terpineol syn相较于其它酶基因在各成熟葡萄果实中的表达量也是最高的，是其它酶基因表达量的10～65倍。
2.2 亲本基因型对无核香味葡萄胚挽救的影响
2.2.1 不同母本基因型对胚挽救的影响
试验设置11个无核香味胚挽救杂交组合，共获得杂种胚珠9731个，杂种苗511株。胚发育率在3.39%～55.63%，成苗率在6.88%～38.82%。
以‘阳光玫瑰’作父本与以‘红宝石无核’及‘莫丽莎无核’作母本的杂种胚成苗率均高于以‘美丽无核’作母本的杂种胚，其成苗率分别达到38.82% 和18.92%。此外，在以‘玫瑰香’作父本配置的香味无核杂交组合中，‘Fresno Seedless’及‘Australian Seedless’作母本的组合成苗率高于以‘昆香无核’‘京早晶’及‘火焰无核’为母本的杂交组合，二者成苗率最高，分别为22.03%和27.60%。父本相同时，以‘红宝石无核’作母本的杂种胚成苗率最高，可达到38.82%（表3）。
2.2.2 不同父本基因型对胚挽救的影响
以‘爱神玫瑰’作为母本与不同香味父本的组合中，‘183’作父本的组合成苗率略高于以‘巨玫瑰’作父本的组合，成苗率为17.07%。以‘昆香无核’作母本与不同香味父本杂交，‘玫瑰香’作父本的组合成苗率（18.75%）明显高于以‘贵妃玫瑰’作父本的杂交组合。母本相同时，以‘玫瑰香’作父本的杂种胚成苗率最高，可达到18.75%（表3）。
2.3 取样时间对无核香味葡萄胚挽救的影响
胚挽救杂交组合‘京早晶×玫瑰香’在授粉后第42天胚发育率最高，达到13.33%；授粉后的36 d，成苗率最高，为18.18%；而在授粉后第38天，胚发育率为0。
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图1 成熟果实中萜类物质合成酶相关基因表达
Figure 1 Expression of monoterpene syntha related genes in mature berries
注：1. 无核白；2. 莎巴珍珠；3. 巨玫瑰；4. 阳光玫瑰；5. 玫瑰香；6. 早玫瑰；7. 意大利；8. 183；
相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著（P ＜0.05）
Note: 1. Thompson Seedless; 2. Pearl of Csaba; 3. Jumeigui; 4. Shine Muscat; 5. Muscat Hamburg; 6. Zaomeigui ; 7. Italia; 8.183; the same letter indicates that the difference is not significant, and the different letters indicate that the difference is significant (P ＜0.05)
