第四军医大学
硕士学位论文
流行性乙型脑炎病毒E蛋白及其结构域Ⅲ的原核表达及酵母双杂
加油的英语怎么说交系统的初步构建
姓名：***
心理调整申请学位级别：硕士实际上英文
专业：微生物学
the departed
指导教师：***
20070501
第四军医大学硕士学位论文
英文缩略词表
Ab antibody 抗体
pair 碱基对
bp ba
BSA bovine rum albumin 牛血清白蛋白
DNA 互补DNA
cDNA complementary
d day 日
幸福终点站美国版电影pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯
DEPC diethyl
triphosphate 脱氧三磷酸核苷
dNTP deoxiyribonucleoside
bromide 溴化乙锭
皮肤护理步骤EB ethidium
ELISA Enzyme linked immunoabsordent 酶联免疫吸附试验
peroxida 辣根过氧化物酶
HRP Horradish
h hour 小时
武大谴责樱花雨thio-β-D-galactoside 异丙基硫代-β- D半乳糖苷IPTG Isopropyl
encephalitis 日本脑炎
JE Japane
virus 日本脑炎病毒
如何调整心态
encephalitis
JEV Japane
dalton 千道尔顿
kD Kilo
kb Kili ba pair 千碱基对
（medium） LB培养基
LB Luria-Bertani
min minute 分
antibody 单克隆抗体
mAb monocolonal
density 光密度
OD Optical
OPD o-phenylenediamine 邻苯二胺
electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE polyacrylamide
report是什么意思gel
PBS phosphate buffer solution 磷酸盐缓冲液
独创性声明
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论文作者签名： 日期：
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论文作者签名：导师签名： 日期：
流行性乙型脑炎病毒E蛋白及其
结构域Ⅲ的原核表达及酵母双杂交系统的初步构建
硕士研究生：高淑娴
导师：徐志凯教授
辅导老师：张伟博士
jethro
任君萍实验师
第四军医大学微生物学教研室，西安，710032
中文摘要
流行性乙型脑炎简称乙脑，是由乙脑病毒（也称日本脑炎病毒，Japane encephalitis virus，JEV）引起、由蚊虫传播的一种急性病毒性传染病，主要侵害中枢神经系统，对人类健康威胁很大。WHO估计，目前乙脑每年发病约50000例，其中约1/3的病例死亡，且乙脑后遗症严重，存活者20%~40%留有神经麻痹和心理改变等严重后遗症，给家庭和社会造成了巨大的经济和精神负担。近几年我国乙脑报告病例数每年在5000～10000例之间，病死率约5%-35%，且有15%的幸存者可发生严重的神经精神后遗症。尽管目前对JEV 的分子生物学、免疫学特性的研究和乙脑的临床救治等取得了很大的进展，疫苗的应用也使乙脑的发病率有所下降，但是关于JEV感染的分子机制还不完全清楚。
病毒受体决定了病毒的宿主范围、组织及细胞亲嗜性，并影响其致病性。一般认为JEV囊膜糖蛋白E是该病毒的受体结合蛋白（V AP），能够介导病毒与细胞的膜融合。研究发现E蛋白抗原决定簇分为三个区，即结构域Ⅰ、结
构域Ⅱ和结构域Ⅲ。其中结构域Ⅱ被认为具有中和与血凝活性的表位，而结构域Ⅲ是受体的主要结合部位，能够介导病毒与细胞的膜融合。
本研究利用大肠埃希菌表达了JEV的E蛋白和E蛋白的结构域Ⅲ，还构建了以JEV的E蛋白为诱饵蛋白的酵母双杂交系统，为进一步研究JEV E蛋白的结构与功能特别是与其受体蛋白的相互作用提供了物
质基础。
1．JEV E蛋白的原核表达及其鉴定
从JEV感染乳鼠脑中提取总RNA，采用特异性引物扩增出JEV E蛋白基因。将E基因克隆到pMD18-T载体中，经酶切鉴定和序列测定无误后，再将该基因克隆到表达载体pET28a中，并转化E. coli后进行诱导表达。SDS-PAGE 鉴定结果表明，在相对分子质量约53kDa处有明显的条带，与预期的6His-E 融和蛋白大小一致；表达蛋白主要以包涵体形体存在于沉淀中。薄层扫描显示目的蛋白占菌体总蛋白的40%。采用Ni2+-NTA亲和色谱柱进行纯化，获得了纯化的JEV E蛋白。Western blot分析结果表明，表达的JEV E蛋白较好地保持了与抗JEV mAb和多抗的结合活性。
2．JEV E蛋白结构域Ⅲ的原核表达及其鉴定
从JEV感染乳鼠脑中提取总RNA，采用特异性引物扩增出JEV E蛋白结构域Ⅲ的基因。将结构域Ⅲ的基因克隆到pMD18-T载体中，经酶切鉴定和序列测定无误后，再将该基因克隆到表达载体pET32a中，并转化E. coli后进行诱导表达。SDS-PAGE鉴定结果表明，在相对分子质量约20kDa处有明显的条带，与预期的6His-E-Ⅲ融和蛋白大小一致；表达蛋白约50％以包涵体形体存在于沉淀中，50%以可溶性形式存在于上清中。薄层扫描显示目的蛋白占菌体总蛋白的40%。采用Ni2+-NTA亲和色谱柱进行纯化，获得了纯化的JEV E 蛋白结构域Ⅲ蛋白。采用抗his mAb进行Western blot分析，结果表明，表
达的该融合蛋白较好地保持了与抗体的结合活性。
